インフルエンザ核酸分子及びそれから作製したワクチン

著者らは特許

A61K39/00 - 抗原または抗体を含有する医薬品製剤(免疫分析用物質G01N33/53)
A61K39/12 - ウイルス抗原
A61K39/145 - オルソミクソウィルス科,例.インフルエンザウィルス
C07K - ペプチド(β−ラクタム環含有ペプチドC07D;環状ジペプチドであって,その分子中にその環を形成するペプチド結合以外のペプチド結合を有しないもの,例.ピペラジン−2,5−ジオンC07D;環状ペプチド型の麦角アルカロイドC07D519/02;単細胞蛋白質,酵素C12N;ペプチドを得るための遺伝子工学的方法C12N15/00)
C07K14/005 - ウイルスから
C12N - 微生物または酵素;その組成物(殺生物剤,有害生物忌避剤または誘引剤,または植物生長調節剤であって,微生物,ウイルス,微生物菌類,酵素,発酵生産物,または微生物または動物材料から生産されたまたは抽出された物質を含むものA01N63/00;医薬品製剤A61K;肥料C05F);微生物の増殖,保存,維持;突然変異または遺伝子工学;培地(微生物学的試験用の培地C12Q1/00)
C12N7/00 - ウイルス,例.バクテリオファージ;それを含む組成物;その調製または精製(ウイルスを含む医薬品製剤A61K35/76;医薬用ウイルス性抗原または抗体組成物の調製,例.ウイルスワクチン,A61K39/00)

の所有者の特許 JP2016517414:

ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア

 

HA赤血球凝集素及び/またはインフルエンザB型赤血球凝集素の新規なコンセンサスアミノ酸配列をコードする核酸配列、ならびにその配列を発現する遺伝子構築物/ベクター及びワクチンを本明細書に提供する。また、提供されるワクチンを用いて1つ以上のインフルエンザA型血清型及び/もしくはインフルエンザB型血清型、またはそれらの組み合わせに対する免疫応答の発生方法も、本明細書に提供する。

 

 

関連出願の相互参照
本出願は、2013年3月15日に出願された米国仮特許出願第61/787,182号に対する優先権の利益を主張するものであり、その各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、改良されたインフルエンザウイルスワクチン、インフルエンザに対する免疫応答を誘導する改良された方法、ワクチン接種を受けたインフルエンザ哺乳動物宿主対感染したインフルエンザ哺乳動物宿主を診断するためならびにインフルエンザに対して個体を予防的及び/または治療的に免疫するための改良された方法に関する。
インフルエンザ(通常、フルと呼ばれる)は、オルトミクソウイルス科のRNAウイルスにより引き起こされる感染症である。インフルエンザウイルスまたはフルウイルスは、トリ及び哺乳動物に感染する。オルトミクソウイルス科の5つの属のうちの3つがインフルエンザウイルスである:インフルエンザA型、インフルエンザB型、及びインフルエンザC型。これらのうち、インフルエンザA型が最も一般的である。
インフルエンザは通常、咳またはくしゃみにより生じたエアロゾル中の空気を介して及びウイルスを含む体液または汚染された表面との直接接触により伝染する。インフルエンザの季節的流行は世界中で発生し、1年に数十万人が死亡する。年によっては、流行病が起こり、数百万人が死亡する。さらに、家畜(特に家禽類及びブタ)も、年に一度の流行病及び時々起こる流行病に感染しやすく、多数の動物が死に、大きな金銭的損失が生じる。
インフルエンザウイルスは構造的に似ており、同様な分子成分で構成される約80〜120nmのほぼ球状または繊維状のウイルス粒子を有する。ウイルスタンパク質及びウイルスRNAを含む中心コアは、ウイルス粒子が生成される細胞に由来する1つの脂質コート及び2つの異なる糖タンパク質で構成されるウイルスエンベロープに囲まれている。ウイルスエンベロープ内にはさらに2つの異なる糖タンパク質が固定されており、これらは表面上で外側に向かって突出した部分を含む。
インフルエンザウイルスRNAゲノムは通常、8個の異なる一本鎖マイナス鎖RNAセグメントとして与えられ、これらが11個のタンパク質(HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NEP、PA、PB1、PB1−F2、PB2)をコードするゲノムの11個のウイルス遺伝子を構成している。8個のRNAセグメントは以下の通りである:1)赤血球凝集素をコードするHA(1個のビリオンを作るのに約500分子の赤血球凝集素が必要);2)ノイラミニダーゼをコードするNA(1個のビリオンを作るのに約100分子のノイラミニダーゼが必要);3)核タンパク質をコードするNP;4)同じRNAセグメントの異なる読み枠を用いて2個のマトリックスタンパク質(M1及びM2)をコードするM(1個のビリオンを作るのに約3000個のマトリックスタンパク質分子が必要);5)同じRNAセグメントの異なる読み枠を用いて2個の別個の非構造タンパク質(NS1及びNEP)をコードするNS;6)RNAポリメラーゼをコードするPA;7)同じRNAセグメントの異なる読み枠を用いてRNAポリメラーゼ及びPB1−F2タンパク質(アポトーシスを誘導する)をコードするPB1;及び8)RNAポリメラーゼをコードするPB2。
これら11個のタンパク質のうち、赤血球凝集素(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)は、ウイルスエンベロープ中に固定されてウイルス粒子の外面に存在する2つの大きな糖タンパク質である。これらのタンパク質は、インフルエンザに対する免疫応答の免疫原となる。HAは、標的細胞へのウイルスの結合及び標的細胞中へのウイルスゲノムの侵入を仲介するレクチンであり、単一遺伝子産物HA0として発現され、その後、宿主のプロテアーゼによりプロセシングされて2個のサブユニットHA1及びHA2を生成し、これらは一緒になってインフルエンザウイルス粒子表面上で複合体を形成する。NAは、感染細胞中で新たに生成された成熟ウイルス粒子の放出に関与する。
インフルエンザA型ウイルスには16個のHA血清型及び9個のNA血清型が知られている。ウイルス粒子中に存在する異なる血清型を特定することによりウイルスは通常記述される。例えば、H1N1は、HA血清型がH1、NA血清型がN1のインフルエンザウイルスであり、H5N1は、HA血清型がH5、NA血清型がN1のインフルエンザウイルスである。H1、H2、及びH3血清型ならびにN1及びN2血清型だけが通常ヒトに感染する。
インフルエンザ株は通常、種または属に特異的である。すなわち、ブタに感染できるインフルエンザ株(ブタインフルエンザウイルス)は通常、ヒトまたはトリには感染せず、トリに感染できるインフルエンザ株(トリインフルエンザウイルス)はヒトまたはブタに感染せず、ヒトに感染できるインフルエンザ株(ヒトインフルエンザウイルス)はトリまたはブタに感染しない。しかし、インフルエンザ株は、変異して、1つの種から別の種に感染可能になることがある。例えば、ブタにだけ感染する株(ブタインフルエンザ)が、変異または組み換えにより、ヒトだけまたはブタ及びヒトの両方に感染できる株になることがある。「ブタインフルエンザ」と一般的に呼ばれるインフルエンザウイルスは、ヒトに感染できる、以前はブタに特異的であった株に由来するインフルエンザウイルス株(H1N1株等)である(すなわち、ブタインフルエンザウイルスはブタ起源ヒトインフルエンザまたはブタ由来ヒトインフルエンザである)。「トリインフルエンザ」と一般的に呼ばれるインフルエンザウイルスは、ヒトに感染できる、以前にトリに特異的であった株に由来するインフルエンザウイルス株(H5N1株等)である(すなわちトリインフルエンザウイルスはトリ起源ヒトインフルエンザまたはトリ由来ヒトインフルエンザである)。
先進国の多くの人々及び時には家畜に、インフルエンザに対するワクチン接種が季節的に行われる。ワクチンによって誘導される免疫応答は特定のサブタイプのウイルスに特異的なため、使用されるワクチンの防御効果は限定的である。毎年、その年にどの種類及び株のウイルスが循環するかについての国際的調査及び科学者の予測に基づいて、異なるインフルエンザワクチンが開発及び投与される。ウイルスは、セグメントの変異、組み換え、及び再構築により大きく変化する。したがって、ある年に与えられたワクチンは、翌年に広く伝染する季節性の株に対して防御効果を有しないと考えられる。
アメリカ疾病管理予防センターが一般に奨励する「インフルエンザ予防接種(flu shot)」は通常3種類の死菌/不活化インフルエンザウイルス、すなわち1つのA(H3N2)ウイルス、1つのA(H1N1)ウイルス、及び1つのBウイルスを含む。そのため、サブタイプの予測及びそのサブタイプに対する特異的ワクチンの利用可能性によりワクチン接種が制限されていることは明らかである。
動物及びヒト疾患に対するワクチン接種のための核酸配列の直接投与が研究され、所望の抗原の必要な発現を得、それによる免疫原性応答を得るため、そして究極的にはこの技術を成功させるために、効果的かつ効率的な核酸送達手段に多くの努力がなされてきた。
DNAワクチンには、生菌弱毒ウイルス及び組み換えタンパク質ベースのワクチンを初めとする従来のワクチン接種法と比べて多くの概念的利点がある。DNAワクチンは、安全であり、安定しており、生成が容易であり、かつ前臨床試験においてヒトに十分耐性があり、プラスミド統合の形跡をほとんど示さない。[Martin,T.,et al.,Plasmid DNA malaria vaccine:the potential for genomic integration after intramuscular injection.Hum Gene Ther,1999.10(5):p.759−68;Nichols,W.W.,et al.,Potential DNA vaccine integration into host cell genome.Ann N Y Acad Sci,1995.772:p.30−9]。さらに、DNAワクチンは、ベクターに対する予め存在する抗体の力価にワクチンの有効性が影響されないため、反復投与に非常に適している[Chattergoon,M.,J.Boyer,and D.B.Weiner,Genetic immunization:a new era in vaccines and immune therapeutics.FASEB J,1997.11(10):p.753−63]。しかしながら、DNAワクチンの臨床的な採用における1つの主要な障害は、より大きな動物へ移動するときにプラットフォームの免疫原性が減少することである[Liu,M.A. and J.B.Ulmer,Human clinical trials of plasmid DNA vaccines.Adv Genet,2005.55:p.25−40]。コドン最適化、RNA最適化、免疫グロブリンリーダー配列の添加等、DNAワクチン免疫原等の工学における最近の技術の進歩により、DNAワクチンの発現及び免疫原性が改善され、[Andre,S.,et al.,Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage.J Virol,1998.72(2):p.1497−503;Deml,L.,et al.,Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein.J Virol,2001.75(22):p.10991−1001;Laddy,D.J.,et al.,Immunogenicity of novel consensus−based DNA vaccines against avian influenza.Vaccine,2007.25(16):p.2984−9;Frelin,L.,et al.,Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene.Gene Ther,2004.11(6):p.522−33]、また、電気穿孔等のプラスミド送達システムにおける技術が最近開発された[Hirao,L.A.,et al.,Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques.Vaccine,2008.26(3):p.440−8;Luckay,A.,et al.,Effect of plasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the resulting vaccine−specific immune responses in rhesus macaques.J Virol,2007.81(10):p.5257−69;Ahlen,G.,et al.,In vivo electroporation enhances the immunogenicity of hepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA by increased local DNA uptake,protein expression,inflammation,and infiltration of CD3+ T cells.J Immunol,2007.179(7):p.4741−53]。さらに、研究は、コンセンサス免疫原の使用は、単独の天然抗原と比較して、細胞性免疫応答の幅を増大させることができることを示唆した[Yan,J.,et al.,Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV−1 subtype B consensus−based envelope DNA vaccine.Mol Ther,2007.15(2):p.411−21;Rolland,M.,et al.,Reconstruction and function of ancestral center−of−tree human immunodeficiency virus type 1 proteins.J Virol,2007.81(16):p.8507−14]。
プラスミドDNA等の核酸配列を送達する方法の1つは電気穿孔(EP)技術である。この技術は、ブレオマイシン等の抗がん薬を送達するためのヒト臨床試験、及び多数の動物種における多くの前臨床研究において使用されてきた。
免疫原性インフルエンザコンセンサス赤血球凝集素タンパク質、そのようなタンパク質をコードする核酸構築物、及びインフルエンザの複数の株に対する広範な交差応答である哺乳動物における免疫応答を誘導するのに有用な組成物に対するニーズが依然として存在する。インフルエンザの複数の株に対する交差防御の能力を含む、個体を処置するための、経済的でありかつ多くのインフルエンザサブタイプに有効な、インフルエンザに対する効果的なワクチンに対するニーズがある。
本発明は、ワクチンが種々のインフルエンザ株に対する交差反応性を提供する多種コンセンサスサブタイプのワクチンを提供する。一実施形態において、ワクチンは、少なくとも1つのコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む。
一実施形態において、コンセンサス赤血球凝集素抗原は、H1赤血球凝集素、H2赤血球凝集素、H3赤血球凝集素、及びインフルエンザB型赤血球凝集素、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
一実施形態において、H1赤血球凝集素は、HS09、H1Bris、H1TT、H1U、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
一実施形態において、H3赤血球凝集素は、H3HA−1、H3HA−2、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
一実施形態において、インフルエンザB型赤血球凝集素は、BHA−1、BHA−2、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
一実施形態において、HS09は、配列番号2をコードする核酸配列、配列番号2をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号2をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号2をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
一実施形態において、H1Brisは、配列番号20をコードする核酸配列、配列番号20をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号20をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号20をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
一実施形態において、H1TTは、配列番号22をコードする核酸配列、配列番号22をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号22をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号22をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
一実施形態において、H1Uは、配列番号36をコードする核酸配列、配列番号36をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号36をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号36をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
一実施形態において、HS09は、配列番号1、配列番号1に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号1のフラグメント、配列番号1のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
一実施形態において、H1Brisは、配列番号19、配列番号19に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号19のフラグメント、配列番号19のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
一実施形態において、H1TTは、配列番号21、配列番号21に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号21のフラグメント、配列番号21のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
一実施形態において、H1Uは、配列番号35、配列番号35に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号35のフラグメント、配列番号35のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
一実施形態において、H3HA−1は、配列番号38をコードする核酸配列、配列番号38をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号38をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号38をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
一実施形態において、H3HA−2は、配列番号24をコードする核酸配列、配列番号24をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号24をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号24をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
一実施形態において、H3HA−1は、配列番号37、配列番号37に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号37のフラグメント、配列番号37のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
一実施形態において、H3HA−2は、配列番号23、配列番号23に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号23のフラグメント、配列番号23のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
一実施形態において、BHA−1は、配列番号14をコードする核酸配列、配列番号14をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号14をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号14をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
一実施形態において、BHA−2は、配列番号26をコードする核酸配列、配列番号26をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号26をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号26をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
一実施形態において、BHA−1は、配列番号13、配列番号13に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号13のフラグメント、配列番号13のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
一実施形態において、BHA−2は、配列番号25、配列番号25に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号25のフラグメント、配列番号25のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
本発明はまた、哺乳動物における種々のインフルエンザ株に対する交差反応性を誘導する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、それを必要とする哺乳動物に本発明のワクチンを投与することを含む。一実施形態において、本発明のワクチンは、少なくとも1つのコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む。
一実施形態において、コンセンサス赤血球凝集素抗原の各々は、哺乳動物に別々に投与される。一実施形態において、コンセンサス赤血球凝集素抗原の各々は、哺乳動物に同時に投与される。
配列番号1、配列番号1に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号1のフラグメント、配列番号1のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号6、配列番号6に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号6のフラグメント、配列番号6のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号9、配列番号9に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号9のフラグメント、配列番号9のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号13、配列番号13に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号13のフラグメント、配列番号13のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号19、配列番号19に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号19のフラグメント、配列番号19のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号21、配列番号21に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号21のフラグメント、配列番号21のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号23、配列番号23に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号23のフラグメント、配列番号23のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号25、配列番号25に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号25のフラグメント、配列番号25のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号27、配列番号27に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号27のフラグメント、配列番号27のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号29、配列番号29に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号29のフラグメント、配列番号29のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号31、配列番号31に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号31のフラグメント、配列番号31のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号33、配列番号33に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号33のフラグメント、配列番号33のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号35、配列番号35に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号35のフラグメント、配列番号35のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;及び配列番号37、配列番号37に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号37のフラグメント、配列番号37のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む単離された核酸分子が本明細書において提供される。
本発明のいくつかの態様において、配列番号2をコードする核酸配列、配列番号2をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号2をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号2をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号7をコードする核酸配列、配列番号7をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号7をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号7をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号10をコードする核酸配列、配列番号10をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号10をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号10をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号14をコードする核酸配列、配列番号14をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号14をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号14をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号20をコードする核酸配列、配列番号20をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号20をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号20をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号22をコードする核酸配列、配列番号22をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号22をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号22をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号24をコードする核酸配列、配列番号24をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号24をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号24をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号26をコードする核酸配列、配列番号26をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号26をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号26をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号28をコードする核酸配列、配列番号28をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号28をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号28をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号30をコードする核酸配列、配列番号30をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号30をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号30をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号32をコードする核酸配列、配列番号32をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号32をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号32をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号34をコードする核酸配列、配列番号34をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号34をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号34をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号36をコードする核酸配列、配列番号36をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号36をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号36をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;及び配列番号38をコードする核酸配列、配列番号38をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号38をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号38をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される単離された核酸分子が存在する。
以下を含む組成物が提供される:a)以下のうちの1つ以上からなる群から選択される第1の核酸配列のうちの1つ以上:配列番号1、配列番号1に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号1のフラグメント、配列番号1のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号6、配列番号6に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号6のフラグメント、配列番号6のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号9、配列番号9に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号9のフラグメント、配列番号9のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号13、配列番号13に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号13のフラグメント、配列番号13のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号19、配列番号19に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号19のフラグメント、配列番号19のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号21、配列番号21に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号21のフラグメント、配列番号21のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号23、配列番号23に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号23のフラグメント、配列番号23のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号25、配列番号25に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号25のフラグメント、配列番号25のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号27、配列番号27に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号27のフラグメント、配列番号27のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号29、配列番号29に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号29のフラグメント、配列番号29のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号31、配列番号31に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号31のフラグメント、配列番号31のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号33、配列番号33に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号33のフラグメント、配列番号33のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号35、配列番号35に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号35のフラグメント、配列番号35のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;及び配列番号37、配列番号37に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号37のフラグメント、配列番号37のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;及びb)以下のうちの1つ以上からなる群から選択されるタンパク質をコードする第2の核酸配列のうちの1つ以上:インフルエンザA型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、インフルエンザB型赤血球凝集素、またはノイラミニダーゼ、またはそれらのフラグメント。
また、以下を含む組成物が提供される:a)以下のうちの1つ以上からなる群から選択される第1の核酸配列のうちの1つ以上:配列番号2をコードする核酸配列、配列番号2をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号2をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号2をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号7をコードする核酸配列、配列番号7をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号7をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号7をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号10をコードする核酸配列、配列番号10をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号10をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号10をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号14をコードする核酸配列、配列番号14をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号14をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号14をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号20をコードする核酸配列、配列番号20をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号20をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号20をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号22をコードする核酸配列、配列番号22をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号22をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号22をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号24をコードする核酸配列、配列番号24をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号24をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号24をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号26をコードする核酸配列、配列番号26をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号26をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号26をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号28をコードする核酸配列、配列番号28をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号28をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号28をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号30をコードする核酸配列、配列番号30をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号30をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号30をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号32をコードする核酸配列、配列番号32をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号32をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号32をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号34をコードする核酸配列、配列番号34をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号34をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号34をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号36をコードする核酸配列、配列番号36をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号36をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号36をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;及び配列番号38をコードする核酸配列、配列番号38をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号38をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号38をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;及びb)以下のうちの1つ以上からなる群から選択されるタンパク質をコードする第2の核酸配列:インフルエンザA型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、インフルエンザB型赤血球凝集素、またはノイラミニダーゼ、またはそれらのフラグメント。
いくつかの態様において、以下等の組み合わせを有し得るワクチンが存在する:
a) インフルエンザウイルスの複数の株に対して、哺乳動物において広範な交差反応性の免疫応答を生じさせることが可能である、第1のインフルエンザ核酸配列H1赤血球凝集素のうちの1つ以上であって、以下から選択される:
以下からなる群から選択される核酸配列:配列番号1、配列番号1に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号1のフラグメント、配列番号1のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号9、配列番号9に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号9のフラグメント、配列番号9のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号19、配列番号19に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号19のフラグメント、配列番号19のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号21、配列番号21に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号21のフラグメント、配列番号21のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号35、配列番号35に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号35のフラグメント、配列番号35のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号2をコードする核酸配列、配列番号2をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号2をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号2をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号10をコードする核酸配列、配列番号10をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号10をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号10をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号20をコードする核酸配列、配列番号20をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号20をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号20をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号22をコードする核酸配列、配列番号22をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号22をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号22をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号36をコードする核酸配列、配列番号36をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号36をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号36をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列。
b) インフルエンザウイルスの複数の株に対して、哺乳動物において広範な交差反応性の免疫応答を生じさせることが可能である、第1のインフルエンザ核酸配列H3赤血球凝集素のうちの1つ以上であって、以下から選択される:
以下からなる群から選択される核酸配列:配列番号23、配列番号23に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号23のフラグメント、配列番号23のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号27、配列番号27に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号27のフラグメント、配列番号27のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号29、配列番号29に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号29のフラグメント、配列番号29のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号37、配列番号37に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号37のフラグメント、配列番号37のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号24をコードする核酸配列、配列番号24をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号24をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号24をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号28をコードする核酸配列、配列番号28をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号28をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号28をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号30をコードする核酸配列、配列番号30をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号30をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号30をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号38をコードする核酸配列、配列番号38をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号38をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号38をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列。
c) インフルエンザウイルスの複数の株に対して、哺乳動物において広範な交差反応性の免疫応答を生じさせることが可能である、第1のインフルエンザ核酸配列インフルエンザB型赤血球凝集素のうちの1つ以上であって、以下から選択される:
以下からなる群から選択される核酸配列:配列番号13、配列番号13に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号13のフラグメント、配列番号13のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号25、配列番号25に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号25のフラグメント、配列番号25のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号31、配列番号31に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号31のフラグメント、配列番号31のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号33、配列番号33に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号33のフラグメント、配列番号33のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号14をコードする核酸配列、配列番号14をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号14をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号14をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号26をコードする核酸配列、配列番号26をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号26をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号26をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号32をコードする核酸配列、配列番号32をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号32をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号32をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号34をコードする核酸配列、配列番号34をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号34をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号34をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列。
本発明のいくつかの態様は、調節エレメントに操作可能に連結された本発明の核酸配列を含む発現ベクターを提供する。
本発明のいくつかの態様では、そのような核酸分子及び/または組成物を個体に投与するステップを含む、免疫応答を誘導する方法が提供される。
本発明の別の態様では、感染から個体を防御する方法が提供される。方法は、このような核酸配列または組成物を含む予防有効量の核酸分子を投与するステップであって、核酸配列が前述の個体の細胞中で発現され、インフルエンザの1つ以上の株に対する防御免疫応答が誘導される、投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、免疫応答は、ブタ起源ヒトインフルエンザに対する防御免疫応答である。
本発明のいくつかの態様では、インフルエンザに感染した個体を処置する方法が提供される。方法は、前述の個体に、治療有効量のそのような核酸分子及び/または組成物を投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、免疫応答はインフルエンザの複数の株に対する広範な交差応答である。
2999塩基対の骨格ベクタープラスミドpVAX1(Invitrogen、Carlsbad CA)のマップを示す図である。CMVプロモーターは、塩基137〜724に位置する。T7プロモーター/プライミング部位が塩基664〜683にある。マルチクローニング部位は、塩基696〜811にある。ウシGHポリアデニル化シグナルが塩基829〜1053にある。カナマイシン耐性遺伝子は、塩基1226〜2020にある。pUCオリジンが塩基2320〜2993にある。 Invitrogenから入手可能なpVAX1の配列に基づき、pGX2009の骨格として使用されたpVAX1の配列中に以下の変異が見つかった:C>G 241 CMVプロモーター中C>T 1942 骨格、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(bGHポリA)の下流A>− 2876 骨格、カナマイシン遺伝子の下流C>T 3277 pUC複製起点(Ori)中、高コピー数の突然変異(Nucleic Acid Research 1985を参照されたい)G>C 3753 RNASeH部位の上流のpUC Oriの末端中塩基対2、3、及び4は、CMVプロモーター上流の骨格中でACTからCTGに変化している。 pH1HA09とも呼ばれるプラスミドpGX2009の2つのマップを示す図である。プラスミドpGX2009(配列番号5)の核酸配列は、C末端に連結されたHAタグ(配列番号18)を含むコンセンサスH1アミノ酸配列(配列番号1にコードされるアミノ酸配列番号2)のN末端に連結されたIgEリーダー(アミノ酸配列番号17)を含むコンセンサスH1タンパク質構築物(配列番号3によりコードされるアミノ酸配列番号4)のコード配列を含む。コンセンサスH1タンパク質(配列番号3によりコードされるアミノ酸配列番号4)は、SwiHum Con HA及びH1HA09とラベルされている。 プラスミドpGX2006のマップを示す。プラスミドpGX2006の核酸配列(配列番号8)は、H2HAとラベルされたコンセンサスH2タンパク質(配列番号6によりコードされるアミノ酸配列番号7)のコード配列を含む。 免疫化したフェレットの血清を用いて実施された赤血球凝集抑制試験から得られたデータを示す図である。 新規なH1N1株で免疫されたまたは免疫されていないフェレットの暴露結果を示す図である。 種々のH1HAインフルエンザ株間の遺伝子関係を示す、最近20年間にわたる株の遺伝子のインフルエンザH1赤血球凝集素(H1HA)遺伝子樹を示す。 種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H1U(配列番号35)、HS09(配列番号1)、ConBris(またはH1Bris;配列番号19)、ConTT(またはH1−TT;配列番号21)、コンボ(4H1U、HS09、ConBris、及びConTT全て))の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H1U(配列番号35)、HS09(配列番号1)、ConBris(またはH1Bris;配列番号19)、ConTT(またはH1−TT;配列番号21)、コンボ(4H1U、HS09、ConBris、及びConTT全て))の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H1U(配列番号35)、HS09(配列番号1)、ConBris(またはH1Bris;配列番号19)、ConTT(またはH1−TT;配列番号21)、コンボ(4H1U、HS09、ConBris、及びConTT全て))の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H1U(配列番号35)、HS09(配列番号1)、ConBris(またはH1Bris;配列番号19)、ConTT(またはH1−TT;配列番号21)、コンボ(4H1U、HS09、ConBris、及びConTT全て))の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H1U(配列番号35)、HS09(配列番号1)、ConBris(またはH1Bris;配列番号19)、ConTT(またはH1−TT;配列番号21)、コンボ(4H1U、HS09、ConBris、及びConTT全て))の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H1U(配列番号35)、HS09(配列番号1)、ConBris(またはH1Bris;配列番号19)、ConTT(またはH1−TT;配列番号21)、コンボ(4H1U、HS09、ConBris、及びConTT全て))の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H1U(配列番号35)、HS09(配列番号1)、ConBris(またはH1Bris;配列番号19)、ConTT(またはH1−TT;配列番号21)、コンボ(4H1U、HS09、ConBris、及びConTT全て))の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々の流行性ウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H1U(配列番号35)、HS09(配列番号1)、ConBris(またはH1Bris;配列番号19)、ConTT(またはH1−TT;配列番号21)、コンボ(4H1U、HS09、ConBris、及びConTT全て))の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々の流行性ウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H1U(配列番号35)、HS09(配列番号1)、ConBris(またはH1Bris;配列番号19)、ConTT(またはH1−TT;配列番号21)、コンボ(4H1U、HS09、ConBris、及びConTT全て))の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々の流行性ウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H1U(配列番号35)、HS09(配列番号1)、ConBris(またはH1Bris;配列番号19)、ConTT(またはH1−TT;配列番号21)、コンボ(4H1U、HS09、ConBris、及びConTT全て))の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したモルモット(コンボ(4H1U、HS09、ConBris、及びConTT全て))の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す;9Aはデータポイントを示し、9Bは平均及び標準偏差を示す。 種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したモルモット(コンボ(4H1U、HS09、ConBris、及びConTT全て))の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す;9Aはデータポイントを示し、9Bは平均及び標準偏差を示す。 は、種々の流行性ウイルスに対する、免疫化したモルモット(コンボ(4H1U、HS09、ConBris、及びConTT全て))の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す;10Aはデータポイントを示し、10Bは平均及び標準偏差を示す。 は、種々の流行性ウイルスに対する、免疫化したモルモット(コンボ(4H1U、HS09、ConBris、及びConTT全て))の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す;10Aはデータポイントを示し、10Bは平均及び標準偏差を示す。 11A)A/メキシコ/InDRE4108/2009流行性株、11B)A/メキシコ/InDRE4487/2009流行性株のうちのいずれかに対して(HS09及びH1Uの組み合わせで免疫化した)フェレットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された力価グラフと、インフルエンザの2009H1メキシコ株で暴露したときのフェレットの生存の割合を示すグラフとを示す。 11A)A/メキシコ/InDRE4108/2009流行性株、11B)A/メキシコ/InDRE4487/2009流行性株のうちのいずれかに対して(HS09及びH1Uの組み合わせで免疫化した)フェレットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された力価グラフと、インフルエンザの2009H1メキシコ株で暴露したときのフェレットの生存の割合を示すグラフとを示す。 11A)A/メキシコ/InDRE4108/2009流行性株、11B)A/メキシコ/InDRE4487/2009流行性株のうちのいずれかに対して(HS09及びH1Uの組み合わせで免疫化した)フェレットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された力価グラフと、インフルエンザの2009H1メキシコ株で暴露したときのフェレットの生存の割合を示すグラフとを示す。 種々のBHA株間の遺伝子関係を示す、最近20年間の株の遺伝子のインフルエンザB型赤血球凝集素(BHA)遺伝子樹を示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する免疫前(「プレ」)、投与後1(「PD1」)、投与後2(「PD2」)、または投与後3(「PD3」)の、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の予め免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する免疫前(「プレ」)、投与後1(「PD1」)、投与後2(「PD2」)、または投与後3(「PD3」)の、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の予め免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する免疫前(「プレ」)、投与後1(「PD1」)、投与後2(「PD2」)、または投与後3(「PD3」)の、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の予め免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する免疫前(「プレ」)、投与後1(「PD1」)、投与後2(「PD2」)、または投与後3(「PD3」)の、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の予め免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する免疫前(「プレ」)、投与後1(「PD1」)、投与後2(「PD2」)、または投与後3(「PD3」)、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する免疫前(「プレ」)、投与後1(「PD1」)、投与後2(「PD2」)、または投与後3(「PD3」)、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する免疫前(「プレ」)、投与後1(「PD1」)、投与後2(「PD2」)、または投与後3(「PD3」)、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 は、種々のウイルスに対する免疫前(「プレ」)、投与後1(「PD1」)、投与後2(「PD2」)、または投与後3(「PD3」)、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。注意:図15A〜D、16A〜C、及び17A〜Cにおいて、「コンボ」サンプルは、別途コンボで免疫化したモルモット(BHA−2から別途送達されるBHA−1)であるが、一方、コンボ(混合)でBHA−1及びBHA−2は、混合されて同時に送達された。 は、種々のウイルスに対する免疫前(「プレ」)、投与後1(「PD1」)、投与後2(「PD2」)、または投与後3(「PD3」)、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。注意:図15A〜D、16A〜C、及び17A〜Cにおいて、「コンボ」サンプルは、別途コンボで免疫化したモルモット(BHA−2から別途送達されるBHA−1)であるが、一方、コンボ(混合)でBHA−1及びBHA−2は、混合されて同時に送達された。 は、種々のウイルスに対する免疫前(「プレ」)、投与後1(「PD1」)、投与後2(「PD2」)、または投与後3(「PD3」)、BHA−1(配列番号13)、BHA−2(配列番号25)、コンボ(BHA−1及びBHA−2の両方)の免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。注意:図15A〜D、16A〜C、及び17A〜Cにおいて、「コンボ」サンプルは、別途コンボで免疫化したモルモット(BHA−2から別途送達されるBHA−1)であるが、一方、コンボ(混合)でBHA−1及びBHA−2は、混合されて同時に送達された。 種々のH3HA株間の遺伝子関係を示す、最近20年間の株の遺伝子のインフルエンザH3赤血球凝集素(H3HA)遺伝子樹を示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H3HA−1(配列番号37)、H3HA−2(配列番号23)、コンボ(H3HA−1及びH3HA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H3HA−1(配列番号37)、H3HA−2(配列番号23)、コンボ(H3HA−1及びH3HA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H3HA−1(配列番号37)、H3HA−2(配列番号23)、コンボ(H3HA−1及びH3HA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H3HA−1(配列番号37)、H3HA−2(配列番号23)、コンボ(H3HA−1及びH3HA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H3HA−1(配列番号37)、H3HA−2(配列番号23)、コンボ(H3HA−1及びH3HA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H3HA−1(配列番号37)、H3HA−2(配列番号23)、コンボ(H3HA−1及びH3HA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H3HA−1(配列番号37)、H3HA−2(配列番号23)、コンボ(H3HA−1及びH3HA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H3HA−1(配列番号37)、H3HA−2(配列番号23)、コンボ(H3HA−1及びH3HA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H3HA−1(配列番号37)、H3HA−2(配列番号23)、コンボ(H3HA−1及びH3HA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H3HA−1(配列番号37)、H3HA−2(配列番号23)、コンボ(H3HA−1及びH3HA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。 種々のウイルスに対する、免疫化したマウス(未処置、H3HA−1(配列番号37)、H3HA−2(配列番号23)、コンボ(H3HA−1及びH3HA−2の両方)の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
インフルエンザA型H1及びH2の各々のコンセンサスアミノ酸配列(本明細書でそれぞれ「コンセンサスH1S」または「HS09」(配列番号2)及び「コンセンサスH2」または「H2HA」(配列番号7)と呼ばれる)、合成ハイブリッドコンセンサスH1インフルエンザA赤血球凝集素アミノ酸配列(本明細書で「コンセンサスU2」または「H1U2」(配列番号10)と呼ばれる)、コンセンサスのアミノ酸配列インフルエンザB型赤血球凝集素(本明細書で「コンセンサスBHA」または「BHA−1」(配列番号14)と呼ばれる)、コンセンサスアミノ酸配列H1Bris赤血球凝集素「ConBrisまたは「H1Bris」(配列番号20)、コンセンサスアミノ酸配列H1TT赤血球凝集素「ConTT」「H1TT」(配列番号22)、コンセンサスアミノ酸配列H3赤血球凝集素または「H3HA−2」(配列番号24)、コンセンサスアミノ酸配列インフルエンザB型赤血球凝集素または「BHA−2」(配列番号26)、コンセンサスアミノ酸配列H3赤血球凝集素または「H3HA−3」(配列番号28)、コンセンサスアミノ酸配列H3赤血球凝集素または「H3HA−4」(配列番号30)、コンセンサスアミノ酸配列インフルエンザB型赤血球凝集素または「BHA−3」(配列番号32)、コンセンサスアミノ酸配列インフルエンザB型赤血球凝集素または「BHA−4」(配列番号34)、合成ハイブリッドコンセンサスH1インフルエンザA型赤血球凝集素「コンセンサスU」または「H1U」(配列番号36)、及びコンセンサスアミノ酸配列H3赤血球凝集素または「H3HA−1」(配列番号38)が提供され、これらは、インフルエンザに対する哺乳動物の防御を提供することができる。加えて、コンセンサスH1アミノ酸配列、コンセンサスH2アミノ酸配列、コンセンサスU2アミノ酸配列、及び/またはコンセンサスBHAアミノ酸配列を含むタンパク質が提供される。いくつかの態様において、HS09アミノ酸配列(例えば、配列番号1または配列番号3)、H2HAアミノ酸配列(例えば、配列番号6)、H1U2アミノ酸配列(例えば、配列番号9または配列番号11)、BHA−1アミノ酸配列(例えば、配列番号13または配列番号15)、H1Brisアミノ酸配列(例えば、配列番号19)、H1TTアミノ酸配列(例えば、配列番号21)、H3HA−2アミノ酸配列(例えば、配列番号23)、BHA−2アミノ酸配列(例えば、配列番号25)、H3HA−3アミノ酸配列(例えば、配列番号27)、H3HA−4アミノ酸配列(例えば、配列番号29)、BHA−3アミノ酸配列(例えば、配列番号31)、BHA−4アミノ酸配列(例えば、配列番号33)、H1Uアミノ酸配列(例えば、配列番号35)、及びH3HA−1アミノ酸配列(例えば、配列番号37)を含むタンパク質をコードする核酸配列が提供される。
科学的理論により限定されるものではないが、多種インフルエンザサブタイプに対して幅広く免疫応答(体液性、細胞性、または両方)を誘発するために使用できるワクチンは、以下のうちの1つ以上を含み得る:1)コンセンサスH1HAアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、2)コンセンサスH1HAアミノ酸配列を含むタンパク質、3)コンセンサスH2HAアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、4)コンセンサスH2HAアミノ酸配列を含むタンパク質、5)コンセンサスH1U及び/またはH1U2アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、6)コンセンサスH1U及び/またはH1U2アミノ酸配列を含むタンパク質、7)コンセンサスBHAアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、及び8)コンセンサスBHAアミノ酸配列を含むタンパク質。
以下の構成要素の2つ以上を使用して及び/または組み合わせて、免疫方法を実施し、ワクチンを調製することができる:1)コンセンサスH1アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、2)コンセンサスH1アミノ酸配列を含むタンパク質、3)コンセンサスH2アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、4)コンセンサスH2アミノ酸配列を含むタンパク質、5)コンセンサスU2アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、6)コンセンサスU2アミノ酸配列を含むタンパク質、7)コンセンサスBHAアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、及び8)コンセンサスBHAアミノ酸配列を含むタンパク質。インフルエンザに対するより広い処置のために、インフルエンザA型のH1〜H16、インフルエンザA型のN1〜N9、インフルエンザB型赤血球凝集素、インフルエンザB型ノイラミニダーゼ等の1つ以上のその他のインフルエンザタンパク質及び/またはこれらのタンパク質をコードする遺伝子を以下の構成要素の1つ以上と一緒に使用して及び/または組み合わせて免疫化方法を行い、ワクチンを調製することができる:1)コンセンサスH1アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、2)コンセンサスH1アミノ酸配列を含むタンパク質、3)コンセンサスH2アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、4)コンセンサスH2アミノ酸配列を含むタンパク質、5)コンセンサスU2アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、6)コンセンサスU2アミノ酸配列を含むタンパク質、7)コンセンサスBHAアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、及び8)コンセンサスBHAアミノ酸配列を含むタンパク質。
1.定義。
本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は、文脈により別様に明確に示されない限り、複数形の指示対象を含む。
本明細書における数値範囲の記載には、その間にある同じ精度の各数値が明確に意図される。例えば、6〜9の範囲には、6及び9に加えて7及び8の数値が意図され、6.0〜7.0の範囲には、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、及び7.0が明確に意図される。
a.アジュバント
本明細書において、「アジュバント」とは、後述するDNAプラスミド及びコード核酸配列によりコードされる抗原の免疫原性を高めるために本明細書に記載のDNAプラスミドワクチンに添加される任意の分子を意味する。
b.抗体
本明細書において、「抗体」とは、IgG、IgM、IgA、IgD、もしくはIgEクラスの抗体、またはフラグメント、またはそのフラグメントもしくは派生物(Fab、F(ab’)2、Fd、及び単鎖抗体、二特異性抗体、二重特異性抗体、二機能性抗体、ならびにその派生物を含む)を意味する。抗体は、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に十分な結合特異性を示す、哺乳動物の血清サンプルから単離された抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製抗体、またはその混合物であってよい。
c.コード配列
本明細書において、「コード配列」または「コード核酸」とは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸(RNAまたはDNA分子)を意味する。コード配列はさらに、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞内での発現を指示することができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む、調節エレメントに操作可能に連結された開始シグナル及び終結シグナルを含み得る。
d.相補体
本発明において、「相補体」または「相補的」とは、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ間におけるワトソン・クリック(例えばA−T/U及びC−G)またはフーグスティーン塩基対を形成できる核酸を意味する。
e.コンセンサスまたはコンセンサス配列
本明細書において、「コンセンサス」または「コンセンサス配列」とは、特定のインフルエンザ抗原の多種サブタイプのアラインメント分析に基づくポリペプチド配列を意味する。コンセンサスポリペプチド配列をコードする核酸配列が調製され得る。コンセンサス配列を含むタンパク質及び/またはそのようなタンパクをコードする核酸分子を含むワクチンを用いて、特定のインフルエンザ抗原の多種サブタイプまたは血清型に対する幅広い免疫を誘導することができる。コンセンサスインフルエンザ抗原には、コンセンサスH1、コンセンサスH2等のインフルエンザA型のコンセンサス赤血球凝集素アミノ酸配列、またはインフルエンザB型のコンセンサス赤血球凝集素アミノ酸配列が含まれ得る。
f.一定電流
本明細書において、「一定電流」とは、組織または前述の組織を画定する細胞が、同じ組織に送達される電気パルスの期間中に受けるまたは経験する電流を意味する。電気パルスは本明細書に記載の電気穿孔デバイスによって送達される。本明細書に提供される電気穿孔デバイスがフィードバックエレメントを有する、好ましくは即時的フィードバックを有するので、この電流は、電気パルス存続期間中、前述の組織中で一定のアンペア数である。フィードバックエレメントにより、パルス期間中の組織(または細胞)の抵抗を測定することができ、電気穿孔デバイスが電気パルス(マイクロ秒のオーダー)を通して同じ組織中及びパルス間で電流が一定になるように電気エネルギー出力を変化させる(例えば電圧を上げる)ことが可能になる。いくつかの実施形態において、フィードバックエレメントは制御器を含む。
g.電流フィードバックまたはフィードバック
「電流フィードバック」または「フィードバック」は同じ意味で使用することができ、電極間で組織中の電流を測定することと、及びそれに基づいて電流を一定レベルに維持するためにEPデバイスから送達されるエネルギー出力を変化させることとを含む、所定の電気穿孔デバイスの能動的な応答を意味する。この一定レベルは、パルス列または電気処置の開始前に、使用者により予め設定される。フィードバックは、電気穿孔デバイスの電気穿孔部品、例えば制御器により達成することができ、電気穿孔デバイスの電気回路が、電極間の組織中の電流を連続的に監視し、監視された電流(すなわち組織内の電流)を予め設定された電流と比較し、監視される電流が予め設定されたレベルに維持されるように連続的にエネルギー出力を調整することができる。フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるので、即時的であり得る。
h.分散電流
本明細書において、「分散電流(decentralized current)」とは、本明細書に記載されている電気穿孔デバイスの種々の針電極アレイから送られる電流のパターンであって、パターンが、電気穿孔されている組織の任意の領域において電気穿孔関連熱ストレスの発生を最小化するか好ましくは除去するものを意味する。
i.有効
化合物の「有効量」または「治療有効量」は、化合物が投与される対象に有益な効果を提供するのに十分な化合物の量である。送達ビヒクルの「有効量」は、化合物に効果的に結合するか、またはそれを送達するのに十分な量である。
j.電気穿孔
本明細書で互換的に使用される「電気穿孔」、「電気透過」、または「電気運動強化」(「EP」)とは、生体膜に微細通路(孔)を誘導する膜貫通電場パルスの使用を意味し、それらの存在は、プラスミド、オリゴヌクレオチド、siRNA、薬物、イオン、及び水等の生体分子が、細胞膜の一方の側面から反対側に通過することを可能にする。
k.コードする
「コードする」は、ヌクレオチドの定義された配列(すなわち、rRNA、tRNA、及びmRNA)、またはそれらから結果として得られたアミノ酸の定義された配列及び生物学的特性のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び高分子の合成のためのテンプレートとして機能する遺伝子、cDNA、またはmRNA等のポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異的な配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子に対応するmRNAの転写及び翻訳が、細胞または他の生物学的システムにおいてタンパク質を生成する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。両方のコーディング鎖、mRNA配列と同一であり、通常配列表において提供されるヌクレオチド配列、及び遺伝子またはcDNAの転写のためのテンプレートとして使用される非コーディング鎖は、タンパク質、またはその遺伝子もしくはcDNAの他の産生物をコードすることを指し得る。
l.フィードバック機構
本明細書において、「フィードバック機構」とは、ソフトウェアまたはハードウェア(またはファームウェア)のいずれかによって実施されるプロセスであって、所望の組織のインピーダンス(エネルギーパルス送達の前、間、及び/または後)を受け取り、予め設定された値(好ましくは電流)と比較し、送達されるエネルギーパルスを予め設定された値に調整するプロセスを意味する。フィードバック機構はアナログ閉ループ回路によって実施され得る。
m.フラグメント
核酸配列に関して本明細書に使用される「フラグメント」とは、例えば、インフルエンザA型のH1赤血球凝集素、インフルエンザA型のH2赤血球凝集素、またはインフルエンザB型の赤血球凝集素を含む、全長野生型株インフルエンザ抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発できるポリペプチドをコードする核酸配列またはその一部を意味する。フラグメントは、コンセンサスアミノ酸配列をコードし、配列番号1、6、9、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、及び37を含む、このような配列を構築する種々のヌクレオチド配列と、配列番号2、7、10、14、20、22、24、26、28、30、32、34、36、及び38をコードするヌクレオチド配列とのうちの少なくとも1つから選択されるDNAフラグメントであり得る。DNAフラグメントは、IgEまたはIgG配列等の免疫グロブリンリーダーのコード配列を含み得る。DNAフラグメントの長さは、ヌクレオチド30個以上、45個以上、60個以上、75個以上、90個以上、120個以上、150個以上、180個以上、210個以上、240個以上、270個以上、300個以上、360個以上、420個以上、480個以上、540個以上、600個以上、660個以上、720個以上、780個以上、840個以上、900個以上、960個以上、1020個以上、1080個以上、1140個以上、1200個以上、1260個以上、1320個以上、1380個以上、1440個以上、1500個以上、1560個以上、1620個以上、1680個以上、1740個以上、1800個以上、1860個以上、1820個以上、1880個以上、1940個以上、2000個以上、2600個以上、2700個以上、2800個以上、2900個以上、2910個以上、2920個以上、2930個以上、2931個以上、2932個以上、2933個以上、2934個以上、2935個以上、2936個以上、2937個以上、または2938個以上であり得る。DNAフラグメントは、ヌクレオチド10個未満、20個未満、30個未満、40個未満、50個未満、60個未満、75個未満、90個未満、120個未満、150個未満、180個未満、210個未満、240個未満、270個未満、300個未満、360個未満、420個未満、480個未満、540個未満、600個未満、660個未満、720個未満、780個未満、840個未満、900個未満、960個未満、1020個未満、1080個未満、1140個未満、1200個未満、1260個未満、1320個未満、1380個未満、1440個未満、1500個未満、1560個未満、1620個未満、1680個未満、またはヌクレオチド1740個未満、1800個未満、1860個未満、1820個未満、1880個未満、1940個未満、2000個未満、2600個未満、2700個未満、2800個未満、2900個未満、2910個未満、2920個未満、2930個未満、2931個未満、2932個未満、2933個未満、2934個未満、2935個未満、2936個未満、2937個未満、または2938個未満であり得る。
ポリペプチド配列との関連における「フラグメント」とは、例えばインフルエンザA型のH1赤血球凝集素、インフルエンザA型のH2赤血球凝集素、またはインフルエンザBの赤血球凝集素等の全長野生型株インフルエンザ抗原と交差反応する、哺乳動物において免疫応答を誘発できるポリペプチドを意味する。フラグメントは、配列番号2、7、10、14、20、22、24、26、28、30、32、34、36、及び38を含む本発明の種々のポリペプチド配列のうちの少なくとも1つから選択されるポリペプチドフラグメントであり得る。ポリペプチドフラグメントは、ロスアラモス国立研究所のHA配列データベース等の公的に利用可能なデータベースにより提供されるように、少なくとも1つの抗原性エピトープと接触するように分析される可能性がある。ポリペプチドHAフラグメントは、IgEまたはIgG等の免疫グロブリンリーダーのアミノ酸配列をさらに含むことができる。ポリペプチドフラグメントの長さは、アミノ酸30個以上、45個以上、60個以上、75個以上、90個以上、120個以上、150個以上、180個以上、210個以上、240個以上、270個以上、300個以上、360個以上、420個以上、480個以上、540個以上、600個以上、660個以上、または710個以上であり得る。ポリペプチドフラグメントの長さは、アミノ酸10個未満、20個未満、30個未満、40個未満、50個未満、60個未満、75個未満、90個未満、120個未満、150個未満、180個未満、210個未満、240個未満、270個未満、300個未満、360個未満、420個未満、480個未満、540個未満、600個未満、660個未満、700個未満、701個未満、702個未満、703個未満、704個未満、705個未満、706個未満、707個未満、708個未満、709個未満、または710個未満であり得る。
n.遺伝子構築物
本明細書に使用される際、「遺伝子構築物」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むDNAまたはRNA分子を指す。コード配列には、核酸分子が投与される個体の細胞内での発現を指示することができる、プロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む、調節エレメントに操作可能に結合される開始及び終結シグナルが含まれる。本明細書に使用される際、「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞内に存在する場合にコード配列が発現されるように、タンパク質をコードするコード配列に操作可能に結合される、必要な調節エレメントを含有する遺伝子構築物を指す。
o.同一
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して本明細書に使用される「同一な」または「同一性」とは、その配列が、指定された領域にわたって同じである、指定された割合の残基を有することを意味する。その割合は、2つの配列を最適にアライメントし、指定の領域にわたり2つの配列を比較し、同一の残基が両方の配列に発生する位置の数を判定して、一致する位置の数を得、一致する位置の数を、指定領域内の位置の合計数で除し、その結果に100を掛けて、配列同一性の割合を得ることによって、計算することができる。2つの配列が異なる長さであるか、またはアライメントが1つ以上の末端の食い違いをもたらし、指定の比較領域が、単一の配列のみを含む場合は、単一の配列の残基を、計算の分子ではなく、分母に含める。DNA及びRNAを比較する場合、チミン(T)及びウラシル(U)は同等であると見なすことができる。同一性は、手作業またはBLASTもしくはBLAST2.0等のコンピュータ配列アルゴリズムを使用して実施することができる。
p.インピーダンス
「インピーダンス」は、フィードバック機構を議論する時に使用され得、オームの法則に従って電流値に変換することができ、したがって、予め設定された電流との比較を可能にする。
q.免疫応答
本明細書において、「免疫応答」とは、インフルエンザ赤血球凝集素コンセンサス抗原等の抗原の導入に応答した、宿主免疫系(例えば哺乳動物の免疫系)の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性応答の形態であってもよく、体液性応答の形態であってもよく、両方であってもよい。
r.核酸
本明細書に使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、共有結合で一緒に連結された少なくとも2つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の記述もまた、相補鎖の配列を定義する。したがって、核酸はまた、記述された一本鎖の相補鎖を包含する。所与の核酸と同じ目的に核酸の多くのバリアントを用いることができる。したがって、核酸はまた、実質的に同一の核酸及びその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブをもまた包含する。
核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよく、二本鎖配列部分及び一本鎖配列部分の両方を含有し得る。核酸は、DNA(ゲノム及びcDNAの両方)であってもよく、RNAであってもよく、または核酸がデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組み合わせならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有し得るハイブリッドであってもよい。核酸は、化学合成法または組み換え法によって、得ることができる。
s.操作可能に連結された
本明細書において、「操作可能に連結された(operably linked)」とは、空間的に関係する(spatially connected)プロモーターの制御下における遺伝子の発現を意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の5’(上流)に位置してもよく、3’(下流)に位置してもよい。プロモーターと遺伝子の距離は、プロモーターが由来する遺伝子中におけるプロモーターとそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当該技術分野で既知のように、この距離はプロモーター機能を消失させることなく変えることができる。
t.プロモーター
本明細書において、「プロモーター」とは、細胞中での核酸の発現を付与、活性化、または促進できる合成または天然由来分子を意味する。プロモーターは、その発現をさらに強化する、ならびに/またはその空間的発現及び/もしくは一時的発現を変化させる、1つ以上の特定の転写調節配列を含み得る。プロモーターはさらに、転写開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る遠位性のエンハンサーまたは抑制エレメントを含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、動物等を起源とし得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは器官に関して、または発現が生じる成長段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤等の外部刺激に応答して、構造的または特異的に遺伝子の発現を制御することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージT7プロモーター、バクテリオファージT3プロモーター、SP6プロモーター、lacオペレーター−プロモーター、tacプロモーター、SV40後期プロモーター、SV40初期プロモーター、RSV−LTRプロモーター、CMV IEプロモーター、SV40初期プロモーターまたはSV40後期プロモーター及びCMV IEプロモーターが含まれる。
u.ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本明細書に使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、核酸の複雑な混合物において等、第1の核酸配列(例えば、プローブ)が第2の核酸配列(例えば、標的)とハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列に依存し、環境によって異なる。ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度pHでの特定の配列の熱融解温度(Tm)より約5〜10℃低くなるように選択され得る。Tmは、標的に相補的なプローブの50%が、平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度(定義されたイオン強度、pH、及び核濃度下で)であり得る(標的配列が、過剰に存在するため、Tmにおいて、プローブの50%は、平衡状態にある)。ストリンジェントな条件は、pH7.0〜8.3で塩濃度が約1.0Mナトリウムイオン未満、例えば、約0.01〜1.0Mナトリウムイオン濃度(または別の塩)、温度が、短いプローブ(例えば、約10〜50ヌクレオチド)で少なくとも約30℃、長いプローブ(例えば、約50ヌクレオチド超)で少なくとも約60℃である条件であり得る。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミド等の不安定化剤の添加により達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについては、正のシグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも2〜10倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下を含む:50%ホルムアミド、5×SSC、及び1%SDS、42℃でインキュベートまたは5×SSC、1%SDS、65℃でインキュベート、0.2×SSCで洗浄、ならびに65℃で0.1%SDS。
v.実質的に相補的
本明細書に使用される「実質的に相補的」とは、第1の配列が、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540、630、720、810、900、990、1080、1170、1260、1350、1440、1530、1620、1710、1800、1890、1980、または2070以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたり、第2の配列の相補体と、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%同一であるか、または2つの配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
w.実質的に同一
本明細書において、「実質的に同一」とは、第1の配列が第2の配列の相補体に実質的に相補的である場合、第1及び第2の配列が、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540、630、720、810、900、990、1080、1170、1260、1350、1440、1530、1620、1710、1800、1890、1980、2070、またはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸領域にわたって、または核酸に関して、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%同一であることを意味する。
x.サブタイプまたは血清型
本発明において、「サブタイプ」または「血清型」は同じ意味で使用されており、インフルエンザウイルスに関して、インフルエンザウイルスの遺伝的バリアントを意味し、1つのサブタイプは免疫系によって異なるサブタイプとは別に認識される。
y.バリアント
本明細書において、核酸と関連して使用される「バリアント」とは、(i)参照されているヌクレオチド配列の一部またはフラグメント;(ii)参照されているヌクレオチド配列またはその一部の相補体;(iii)参照されている核酸またはその相補体と実質的に同一な核酸;または(iv)参照されている核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一な配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味する。
ペプチドまたはポリペプチドに関する「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸が異なっているが、少なくとも1つの生物学的活性を保持している。バリアントはまた、少なくとも1つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、1つのアミノ酸を、類似の特性(親水性、荷電領域の程度及び分布)を有する別のアミノ酸と置き換えることは、典型的に小規模な変更を伴うとして、当該技術分野で認識されている。これらの小規模な変更は、当該技術分野において理解されるように、部分的に、アミノ酸のハイドロパシー指標を考慮することによって、特定することができる。Kyte et al.,J.Mol.Biol.157:105−132(1982)。アミノ酸のハイドロパシー指標は、その疎水性及び電荷の考察に基づく。類似のハイドロパシー指標のアミノ酸を置換することができ、依然としてタンパク質の機能を保持することは、当該技術分野で既知である。一態様において、±2のハイドロパシー指標を有するアミノ酸を置換する。アミノ酸の親水性を使用することでも、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換が判明し得る。ペプチドとの関連においてアミノ酸の親水性を考慮することにより、そのペプチドの最大局所平均親水性を計算することが可能となり、これは、抗原性及び免疫原性と十分に相関性があることが報告されている有用な尺度である。米国特許第4,554,101号、参照により本明細書に完全に組み込まれる。同様な親水性値のアミノ酸の置換により、当該技術分野で理解されるように、免疫原性等の生物学的活性を保持したペプチドを得ることができる。置換は、互いに±2以内の親水性値を有するアミノ酸で実施され得る。アミノ酸の疎水性指標及び親水性値のいずれも、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。この見解と一致して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、寸法、及び他の特性によって明らかとなるアミノ酸の相対的類似性、特にそれらのアミノ酸の側鎖に依存することが理解される。
z.ベクター
本明細書に使用される「ベクター」とは、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、DNAまたはRNAベクターであってもよい。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであってもよく、好ましくは、DNAプラスミドである。
範囲:本開示を通して、本発明の種々の態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式における記載は、便宜上及び簡潔さのために過ぎず、本発明の範囲における柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲ならびにその範囲内の個々の数値が具体的に開示されていると考えるべきである。例えば、1〜6等の範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、及び6等の部分範囲が具体的に開示されていると考えるべきである。これは、範囲の広さに関わらず適用される。
2.インフルエンザ抗原
本明細書は、哺乳動物において1つ以上のインフルエンザ血清型に対する免疫応答を誘発することができる抗原を提供する。この抗原は、哺乳動物において、1つ以上のインフルエンザ血清型に対する、例えば2009H1N1ブタ起源インフルエンザ等の1つ以上の流行性株に対する、免疫応答を誘発することができる。抗原は、哺乳動物において、1つ以上のインフルエンザ血清型に対する、例えばブタ由来ヒトインフルエンザの1つ以上の株に対する、免疫応答を誘発することができる。抗原は、抗インフルエンザ免疫応答を誘導できる免疫原としてそれらを特に効果的にするエピトープを含み得る。
抗原は、全長翻訳産物HA0、サブユニットHA1、サブユニットHA2、そのバリアント、そのフラグメント、またはその組み合わせを含み得る。インフルエンザ赤血球凝集素抗原は、インフルエンザA型血清型H1の複数の株に由来するコンセンサス配列、インフルエンザA型血清型H2の複数の株に由来するコンセンサス配列、インフルエンザA型血清型H1の複数の株の異なる集合に由来する2つの異なるコンセンサス配列の一部を含有するハイブリッド配列、またはインフルエンザBの複数の株に由来するコンセンサス配列であり得る。インフルエンザ赤血球凝集素抗原は、インフルエンザB型に由来し得る。抗原は、免疫応答を誘導し得る特定のインフルエンザ免疫原に対して効果的であり得る少なくとも1つの抗原性エピトープを含有し得る。抗原は、無傷のインフルエンザウイルス中に存在する免疫原性部位及びエピトープの全レパートリーを提供し得る。抗原は、1つの血清型の複数のインフルエンザA型ウイルス株(血清型H1または血清型H2の複数のインフルエンザA型ウイルス株等)の赤血球凝集素抗原配列に由来し得るコンセンサス赤血球凝集素抗原配列であり得る。抗原は、2つの異なるコンセンサス赤血球凝集素抗原配列またはその一部の組み合わせに由来し得るハイブリッドコンセンサス赤血球凝集素抗原配列であり得る。2つの異なるコンセンサス赤血球凝集素抗原配列の各々は、血清型H1の複数のインフルエンザA型ウイルス株等の1つの血清型の複数のインフルエンザA型ウイルス株の異なる集合に由来し得る。抗原は、複数のインフルエンザBウイルス株の赤血球凝集素抗原配列に由来し得るコンセンサス赤血球凝集素抗原配列であり得る。
コンセンサス赤血球凝集素抗原は、アミノ酸1〜343が前駆体HA0コンセンサスH1アミノ酸配列のHA1サブユニットに対応しかつアミノ酸344〜566がHA0コンセンサスH1アミノ酸配列のHA2サブユニットに対応する、配列番号2(コンセンサスH1アミノ酸配列)を含むタンパク質であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原はまた、配列番号20(H1Bris)または配列番号22(H1TT)を含むタンパク質等の、H1HA株からの赤血球凝集素配列に由来するコンセンサス赤血球凝集素タンパク質であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、配列番号7(H2HA)を含むタンパク質であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、配列番号24(H3HA−2)、配列番号28(H3HA−3)、配列番号30(H3HA−4)、または配列番号38(H3HA−1)を含むタンパク質等の、H3HA株からの赤血球凝集素配列に由来するコンセンサス赤血球凝集素タンパク質であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、各々が互いに異なる集合の配列に由来する2つの異なるコンセンサスH1配列の一部を含む合成ハイブリッドコンセンサスH1配列であり得る。合成ハイブリッドコンセンサスH1タンパク質であるコンセンサスHA抗原の例は、配列番号10(H1U2)または配列番号36(H1U)を含むタンパク質である。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、配列番号14(BHA−1)、配列番号26(BHA−2)、配列番号32(BHA−3)、または配列番号34(BHA−4)を含むタンパク質等の、インフルエンザB型株からの赤血球凝集素配列に由来するコンセンサス赤血球凝集素タンパク質であり得る。
コンセンサス赤血球凝集素抗原は、1つ以上の付加的アミノ酸配列エレメントをさらに含み得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、N末端にIgEまたはIgGリーダーアミノ酸配列をさらに含み得る。IgEリーダーアミノ酸配列は配列番号17であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、容易に入手可能な抗体によって検出できる固有の免疫原性エピトープである免疫原性タグをさらに含み得る。そのような免疫原性タグの例は、コンセンサス赤血球凝集素C末端に連結され得る9アミノ酸インフルエンザHAタグである。HAタグアミノ酸配列は配列番号18であり得る。いくつかの実施形態において、コンセンサス赤血球凝集素抗原は、N末端にIgEまたはIgGリーダーアミノ酸配列及びC末端にHAタグをさらに含み得る。
コンセンサス赤血球凝集素抗原は、コンセンサスインフルエンザアミノ酸配列またはそのフラグメント及びバリアントからなるコンセンサス赤血球凝集素タンパク質であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、非インフルエンザタンパク質配列及びインフルエンザタンパク質配列またはそのフラグメント及びバリアントを含むコンセンサス赤血球凝集素タンパク質であり得る。
コンセンサスH1タンパク質の例としては、コンセンサスH1アミノ酸配列(配列番号2)からなり得るものあるいはIgEリーダー配列もしくはHAタグまたはIgEリーダー配列及びHAタグの両方等の付加的エレメントをさらに含むものが含まれる。IgEリーダー配列及びHAタグの両方を含むコンセンサスH1タンパク質の例は配列番号4であり、これはN末端にIgEリーダーアミノ酸配列(配列番号17)に連結され、C末端にHAタグ(配列番号18)が連結されたコンセンサスH1アミノ酸コード配列(配列番号2)を含む。
コンセンサスH2タンパク質の例としては、コンセンサスH2アミノ酸配列(配列番号7)からなり得るものあるいはIgEリーダー配列もしくはHAタグまたはIgEリーダー配列及びHAタグの両方をさらに含むものが含まれる。
ハイブリッドコンセンサスH1タンパク質の例としては、コンセンサスU2アミノ酸配列(配列番号10)からなり得るものあるいはIgEリーダー配列もしくはHAタグまたはIgEリーダー配列及びHAタグの両方を含むものが含まれる。コンセンサスU2タンパク質の例は配列番号12であり、これはN末端にIgEリーダーアミノ酸配列(配列番号17)が連結され、C末端にHAタグ(配列番号18)が連結された、コンセンサスU2アミノ酸配列(配列番号10)を含む。
ハイブリッドコンセンサスインフルエンザB赤血球凝集素タンパク質の例としては、コンセンサスBHAアミノ酸配列(配列番号14)からなり得るものが含まれ、あるいは、IgEリーダー配列もしくはHAタグまたはIgEリーダー配列及びHAタグの両方を含み得る。コンセンサスBHAタンパク質の例は配列番号16であり、これは、N末端にIgEリーダーアミノ酸配列(配列番号17)が連結され、C末端にHAタグ(配列番号18)が連結された、コンセンサスBHAアミノ酸配列(配列番号14)を含む。
コンセンサス赤血球凝集素タンパク質は、コンセンサス赤血球凝集素核酸、そのバリアント、またはそのフラグメントにコードされ得る。異なる株及びバリアントの複数の異なる赤血球凝集素配列に由来するコンセンサス配列であり得るコンセンサス赤血球凝集素タンパク質と異なり、コンセンサス赤血球凝集素核酸は、コンセンサスタンパク質配列をコードする核酸配列を指し、使用されるコード配列は、コンセンサス赤血球凝集素タンパク質配列が由来する複数の異なる赤血球凝集素配列中の特定のアミノ酸配列をコードするのに使用されるものとは異なってよい。コンセンサス核酸配列は、最適化されたコドン及び/または最適化されたRNAであってよい。コンセンサス赤血球凝集素核酸配列は、5’非翻訳領域中にコザック配列を含んでよい。コンセンサス赤血球凝集素核酸配列は、リーダー配列をコードする核酸配列を含んでよい。N末端リーダー配列のコード配列は赤血球凝集素コード配列の5’にある。N末端リーダーは分泌を促進し得る。N末端リーダーは、IgEリーダーまたはIgGリーダーであり得る。コンセンサス赤血球凝集素核酸配列は、免疫原性タグをコードする核酸配列を含み得る。免疫原性タグはタンパク質のC末端にあってよく、それをコードする配列はHAコード配列の3’にある。免疫原性タグの与える固有のエピトープに対して容易に入手可能な抗体があるため、それにより、そのような抗体を試験中に用いてタンパク質の発現を検出及び確認することができる。免疫原性タグはタンパク質のC末端のHタグであり得る。
コンセンサス赤血球凝集素核酸は、配列番号2、配列番号7、配列番号10、配列番号14、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、または配列番号38のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有し得る。配列番号2、配列番号7、配列番号10、配列番号14、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、または配列番号38をコードするコンセンサス赤血球凝集素核酸は、それぞれ、配列番号1、配列番号6、配列番号9、配列番号13、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37であり得る。コンセンサス赤血球凝集素核酸は、IgEリーダーアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列もしくはHAタグアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列またはその両方をさらに含んでよい。配列番号17はIgEリーダーポリペプチド配列である。配列番号18はHAタグポリペプチド配列である。IgEリーダー配列及びHAタグをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む赤血球凝集素コンセンサス核酸の例としては、配列番号4、配列番号12、または配列番号16のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子が含まれる。配列番号4、配列番号12、または配列番号16をコードするコンセンサス赤血球凝集素核酸は、それぞれ配列番号3、配列番号11、または配列番号15であり得る。
3.遺伝子構築物及びプラスミド
本明細書において赤血球凝集素抗原をコードする核酸配列を含み得る遺伝子構築物を提供する。遺伝子構築物は、赤血球凝集素抗原をコードする核酸を含む機能性染色体外分子として細胞中に存在し得る。赤血球凝集素抗原をコードする核酸を含む遺伝子構築物は、セントロメアを含む線状ミニ染色体、テロマー、またはプラスミドもしくはコスミドであり得る。
遺伝子構築物はまた、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルス、及び組み換えワクチンを含む、組み換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝子構築物は、細胞内に生存する、弱毒化された生きた微生物または組み換え微生物ベクター中の、遺伝子材料の一部であってもよい。
遺伝子構築物は、赤血球凝集素核酸の遺伝子発現の調節エレメントを含み得る。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。
組成物は、以下の1つ以上の核酸配列を含み得る:配列番号1、配列番号6、配列番号9、配列番号13、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37。組成物は、以下のうちの1つ以上からなる群から選択される赤血球凝集素コンセンサス抗原をコードする第1の核酸配列を含み得る:インフルエンザA型コンセンサス赤血球凝集素H1抗原、インフルエンザA型コンセンサス赤血球凝集素H2抗原、インフルエンザA型コンセンサス赤血球凝集素H1U及び/またはH1U2抗原、ならびにインフルエンザB型コンセンサス赤血球凝集素タンパク質BHA、このBHAは、配列番号1、配列番号6、配列番号9、配列番号13、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、または以下の1つ以上をコードする核酸配列:配列番号2、配列番号7、配列番号10、配列番号14、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、または配列番号38を含むことができ;かつ1つ以上の追加の核酸配列(複数可)をさらに含むことができ、この核酸配列が、以下からなる群から選択される1つ以上のタンパク質(複数可)をコードする:本明細書に提供されるコンセンサス配列のうちの1つ以上を含む、インフルエンザA型赤血球凝集素タンパク質H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、インフルエンザA型ノイラミニダーゼN1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、インフルエンザB型赤血球凝集素(BHA)及びインフルエンザB型ノイラミニダーゼ(BNA)。第1の核酸配列及び付加的核酸配列は、同じ核酸分子上に存在してもよく、異なる核酸分子上に存在してもよい。第1の核酸配列及び付加的核酸配列は、ヒト細胞中で機能する調節エレメントの制御下にあってよい。付加的コード配列は、インフルエンザの1つ以上の株の1つ以上のH1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、BHA、及びBNAをコードしてもよく、または血清型を有する複数の株に由来するコンセンサスであってよく、または2つ以上のコンセンサス配列に由来する配列を含むハイブリッドであってもよい。
核酸配列は、ベクターであり得る遺伝子構築物を構成し得る。ベクターは、哺乳動物中で免疫応答を誘発するのに有効な量のコンセンサス赤血球凝集素抗原を哺乳動物細胞中で発現することができる。ベクターは組み換え体であってよい。ベクターはコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターはプラスミドであってよい。ベクターは、コンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする核酸で細胞をトランスフェクトするのに有用であり得、形質転換された宿主細胞はコンセンサス赤血球凝集素抗原の発現が起こる条件下で培養及び維持される。
ベクターは、コンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする異種核酸を含んでよく、コンセンサス赤血球凝集素コード配列の上流であり得る開始コドン及びコンセンサス赤血球凝集素の下流であり得る終止コドンをさらに含んでよい。開始及び終止コドンは、コンセンサス赤血球凝集素コード配列とインフレームであり得る。ベクターはまた、コンセンサス赤血球凝集素コード配列に操作可能に連結されたプロモーターも含んでよい。コンセンサス赤血球凝集素コード配列に操作可能に連結されるプロモーターは、シミアンウイルス40(SV40)由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)長い末端反復(LTR)プロモーター等のヒト免疫不全ウイルス(HIV)プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス(ALV)プロモーター、CMV前初期プロモーター等のサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、エプスタインバーウイルス(EBV)プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネイン等のヒト遺伝子に由来するプロモーターであってもよい。プロモーターはさらに、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的プロモーター等の組織特異的プロモーターであってもよい。このようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第20040175727号に記載され、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
ベクターはさらに、ポリアデニル化シグナルを含んでもよく、これはHAコード配列の下流であり得る。ポリアデニル化シグナルは、SV40ポリアデニル化シグナル、LTRポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン(hGH)ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。SV40ポリアデニル化シグナルは、pCEP4ベクター(Invitrogen、San Diego、CA)のポリアデニル化シグナルであり得る。
ベクターはさらに、コンセンサス赤血球凝集素コーティングの上流にエンハンサーを含み得る。エンハンサーがDNA発現に必須であってもよい。エンハンサーはヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはウイルスエンハンサー(CMV、HA、RSV、またはEBVに由来するエンハンサー等)であり得る。ポリヌクレオチド機能の強化は、米国特許第5,593,972号、同第5,962,428号、及び国際公開第94/016737号に記載され、各々の内容は、参照により完全に組み込まれる。
ベクターはまた、ベクターを染色体外に維持し、細胞内でベクターの複数のコピーを産生するために、哺乳動物の複製起点を含み得る。ベクターは、Invitrogen(San Diego、CA)のpVAX1(図1)、pCEP4、またはpREP4であり得、これはエプスタインバーウイルス複製起点及び核抗原EBNA−1コード領域を含み得、組み込まれることなく多コピーのエピソーム複製を可能にする。ベクターは、上記の図面の簡単な説明の図1に関するパラグラフに記載されているような変化を有するpVAX1であり得る。ベクターの骨格は、pAV0242であり得る。ベクターは、複製能欠損アデノウイルス5型(Ad5)ベクターであり得る。
ベクターはさらに、ベクターが投与される哺乳動物またはヒトの細胞中における遺伝子発現に良く適し得る調節配列を含み得る。コンセンサス赤血球凝集素コード配列は、宿主細胞中でのコード配列のより効率的な転写を可能にすることができるコドンを含んでよい。
ベクターは、大腸菌(E.coli)でのタンパク質産生に使用可能なpSE420(Invitrogen、San Diego,Calif.)であり得る。ベクターはまた、酵母のサッカロミセス・セレビシエ株におけるタンパク質生成に使用可能なpYES2(Invitrogen、San Diego,Calif.)であってもよい。ベクターはまた、昆虫細胞におけるタンパク質生成に使用可能なMAXBAC(商標)完全バキュロウイルス発現系(Invitrogen、San Diego,Calif.)であってもよい。ベクターはまた、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞等の哺乳動物細胞でのタンパク質産生に使用可能なpcDNA IまたはpcDNA3(Invitrogen、San Diego、Calif.)であってもよい。ベクターは、参照により完全に組み込まれるSambrook et al.,Molecular Cloning an Laboratory Manual,Second Ed.,Cold Spring Harbor(1989)を含む、日常的な技術及び容易に入手可能な開始物質によってタンパク質を生成するための発現ベクターまたは系であってもよい。
ベクターはpGX2009またはpGX2006であってよく、これはコンセンサス赤血球凝集素抗原を発現させるために使用することができる。ベクターpGX2009(4739bp、図2;配列番号5)は、コンセンサスH1アミノ酸配列(配列番号1によりコードされるアミノ酸配列番号2)に連結したIgEリーダー配列(配列番号11によりコードされるアミノ酸配列番号12)を含むコンセンサスH1タンパク質(配列番号3によりコードされるアミノ酸配列番号4)をコードする核酸配列を有する改変pVAX1プラスミドである。ベクターpGX2006(4628bp;図3、配列番号8)は、コンセンサスH2タンパク質(配列番号6によりコードされるアミノ酸配列番号7)をコードする核酸配列を有するpVAX1プラスミドである。代替的に、pGX2006(またはpVAX(Invitrogen)に類似のDNAプラスミド骨格pVAX1において、核酸挿入は、H2HA配列を以下のうちのいずれか1つと交換できる:配列番号1、配列番号6、配列番号9、配列番号13、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、または以下のうちの1つ以上をコードする核酸配列:配列番号2、配列番号7、配列番号10、配列番号14、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、または配列番号38;または本明細書に記載の任意のフラグメント及びバリアント。
配列をコードするコンセンサス赤血球凝集素を含む、本明細書に記載の遺伝子構築物及び構成要素は、インフルエンザA型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、インフルエンザB型赤血球凝集素またはノイラミニダーゼタンパク質等の他のインフルエンザタンパク質を発現するために使用され得、それによって、インフルエンザA型タンパク質H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、インフルエンザB型赤血球凝集素、またはノイラミニダーゼタンパク質のための配列をコードすることが、配列コードするコンセンサス赤血球凝集素の代わりに含まれる。
4.薬学的組成物
約1ナノグラム〜約10mgのDNAを含む本発明に係る薬学的組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、1)少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、もしくは100ナノグラム、または少なくとも1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995、もしくは1000マイクログラム、または少なくとも1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、もしくは10mg以上と、2)最大15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、もしくは100ナノグラム以下、または最大1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995、もしくは1000マイクログラム以下、または最大1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、もしくは10mg以下との間で含まれる。いくつかの実施形態において、本発明による薬学的組成物は、約5ナノグラム〜約10mgのDNAを含む。いくつかの実施形態において、本発明による薬学的組成物は、約25ナノグラム〜約5mgのDNAを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約50ナノグラム〜約1mgのDNAを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約0.1〜約500マイクログラムのDNAを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約1〜約350マイクログラムのDNAを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約5〜約250マイクログラムのDNAを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約10〜約200マイクログラムのDNAを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約15〜約150マイクログラムのDNAを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約20〜約100マイクログラムのDNAを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約25〜約75マイクログラムのDNAを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約30〜約50マイクログラムのDNAを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約35〜約40マイクログラムのDNAを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約100〜約200マイクログラムのDNAを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約10マイクログラム〜約100マイクログラムのDNAを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約20〜約80マイクログラムのDNAを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約25〜約60マイクログラムのDNAを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約30ナノグラム〜約50マイクログラムのDNAを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約35ナノグラム〜約45マイクログラムのDNAを含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約0.1〜約500マイクログラムのDNAを含有する。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約1〜約350マイクログラムのDNAを含有する。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約25〜約250マイクログラムのDNAを含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約100〜約200マイクログラムのDNAを含有する。
本発明に係る薬学的組成物は、使用される投与形態に従って製剤化される。薬学的組成物が注射可能な薬学的組成物である場合、それらは無菌であり、発熱性物質を含まず、微粒子を含まない。好ましくは等張性の製剤が使用される。一般的に、等張性のための添加物には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが含まれ得る。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水等の等張液が好ましい。安定化剤にはゼラチン及びアルブミンが含まれる。いくつかの実施形態では、製剤に血管収縮剤が添加される。
好ましくは、薬学的組成物はワクチンであり、より好ましくはDNAワクチンである。
1つ以上のインフルエンザ血清型に対する免疫応答を哺乳動物で生じさせることができるワクチンを本明細書に提供する。ワクチンは上記の遺伝子構築物を含み得る。ワクチンは、各々が1つ以上のインフルエンザA型血清型(H1〜H16インフルエンザB赤血球凝集素、またはその組み合わせなど)に対する複数のベクターを含み得る。ワクチンは、1つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする1つ以上の核酸配列を含み得る。ワクチンが2以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含む場合、全てのそのような配列が1つの核酸分子上に存在してもよく、そのような配列の各々が異なる核酸分子上に存在してもよい。代替的に、2以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含むワクチンは、1つのコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を有する核酸分子及び2つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を有する核酸分子を含み得る。加えて、1つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含むワクチンは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、及びインフルエンザB型ノイラミニーゼからなる群から選択される1つ以上のタンパク質のコード配列をさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ワクチンはタンパク質を含み得る。いくつかのワクチンは、H1、H2、U2、及びBHA等の1つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含み得る。ワクチンは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、及びインフルエンザB型ノイラミニダーゼからなる群から選択される1つ以上の他のタンパク質を含み得る。ワクチンは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、インフルエンザB型赤血球凝集素、及びノイラミニダーゼからなる群から選択される1つ以上の他のタンパク質と組み合わせて1つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含み得る。
ワクチンは、DNAワクチンであり得る。DNAワクチンは、コンセンサス赤血球凝集素核酸配列の1つ以上を含む複数の同じまたは異なるプラスミドを含み得る。DNAワクチンは、1つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする1つ以上の核酸配列を含み得る。DNAワクチンが2つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含む場合、そのような全配列が1つのプラスミド上に存在してもよく、そのような配列の各々が異なるプラスミド上に存在してもよく、いくつかのプラスミドが1つのコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含んで、他のプラスミドが2つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を有してもよい。加えて、DNAワクチンは、インフルエンザA型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、インフルエンザB型赤血球凝集素及びノイラミニダーゼからなる群から選択される1つ以上のタンパク質のための配列をコードする1つ以上のコンセンサスをさらに含み得る。このような付加的コード配列は、互いに異なりかつコンセンサス赤血球凝集素核酸配列の1つ以上を含むプラスミドとは異なるプラスミド上に存在してもよく、同じプラスミド上に存在してもよい。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザ抗原をコードする核酸配列をインフルエンザ抗原と組み合わせて含み得る。いくつかの実施形態では、核酸配列は、H1(H1U及びH1U2を含む)、H2、H3、及びBHA等の1つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする。いくつかの実施形態では、核酸配列は、インフルエンザA型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、インフルエンザB型赤血球凝集素、及びノイラミニダーゼからなる群から選択される1つ以上の1つ以上の他のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ワクチンは、H1(H1U及びH1U2を含む)、H2、H3、及びBHA等の1つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、インフルエンザA型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、インフルエンザB型赤血球凝集素及びノイラミニダーゼからなる群から選択される1つ以上の1つ以上の他のタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ワクチンは、H1(H1U及びH1U2を含む)、H2、及びBHAのうちの1つ以上をコードするものを含む3つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、コンセンサスH1U及び/またはH1U2、コンセンサスBHA、及びH3赤血球凝集素をコードするものを含む3つ以上の赤血球凝集素核酸配列の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、コンセンサスBHA、H1赤血球凝集素、及びH3赤血球凝集素をコードするものを含む3つ以上の赤血球凝集素核酸配列の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第12/375,518号及び/または参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第12/269,824号に開示されている1つ以上のインフルエンザ抗原をコードする1つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、米国特許出願第12/375,518号(本明細書において配列番号36)及び/または米国特許出願第12/269,824号(本明細書において配列番号9)のH1赤血球凝集素をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、米国特許出願第12/269,824号(本明細書において配列番号11)からのH3赤血球凝集素をコードする核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ワクチンは、H1、H2、U2、及びBHAのうちの1つ以上を含む3つ以上のコンセンサス赤血球凝集素タンパク質の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、コンセンサスU2、コンセンサスBHA、及びH3赤血球凝集素を含む3つ以上の赤血球凝集素タンパク質の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、コンセンサスBHA、H1赤血球凝集素、及びH3赤血球凝集素を含む3つ以上の赤血球凝集素タンパク質の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、米国特許出願第12/375,518号及び/または米国特許出願第12/269,824号の1つ以上の抗原を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、米国特許出願第12/375,518号(本明細書において配列番号37)及び/または米国特許出願第12/269,824号(本明細書において配列番号10)のH1赤血球凝集素を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、米国特許出願第12/269,824号(本明細書において配列番号12)に開示されるH3赤血球凝集素を含む。
いくつかの実施形態において、ワクチンは、1)コンセンサス赤血球凝集素U2タンパク質及び/またはコンセンサス赤血球凝集素U2タンパク質をコードする核酸配列、2)コンセンサス赤血球凝集素BHAタンパク質及び/またはコンセンサス赤血球凝集素BHAタンパク質をコードする核酸配列、3)米国特許出願第12/269,824号(本明細書において配列番号12)に開示される赤血球凝集素H3タンパク質及び/または米国特許出願第12/269,824号(本明細書において配列番号11)に開示される赤血球凝集素H3タンパク質をコードする核酸配列の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ワクチンは、1)コンセンサス赤血球凝集素BHAタンパク質及び/またはコンセンサス赤血球凝集素BHAタンパク質をコードする核酸配列、2)米国特許出願第12/269,824号(本明細書において配列番号10)もしくは米国特許出願第12/375,518号(本明細書において配列番号37)に開示される赤血球凝集素H1タンパク質及び/または米国特許出願第12/269,824号(本明細書において配列番号9)もしくは米国特許出願第12/375,518号(本明細書において配列番号36)に開示される赤血球凝集素H1タンパク質をコードする核酸配列、3)米国特許出願第12/269,824号(本明細書において配列番号12)に開示される赤血球凝集素H3タンパク質及び/または米国特許出願第12/269,824号(本明細書において配列番号11)に開示される赤血球凝集素H3タンパク質をコードする核酸配列の組み合わせを含む。
好ましくは、本明細書に提供される抗原の組み合わせは、広範囲のインフルエンザの季節性株及びさらにインフルエンザの流行性株に対して交差反応性を提供するワクチン接種を受けた哺乳動物における血清変換を引き起こすワクチンに対して製剤化できる。血清変換及び広い交差反応性は、インフルエンザの異なる赤血球凝集素株に対して阻害力価を測定することによって判定することができる。好ましい組み合わせは、以下の群からの少なくとも1つの抗原を含む:1)コンセンサスH1赤血球凝集素、2)コンセンサスH2赤血球凝集素、3)コンセンサスH3赤血球凝集素、及び4)インフルエンザB赤血球凝集素;より好ましい組み合わせは、以下の群からの少なくとも1つの抗原を含む:1)コンセンサスH1赤血球凝集素、2)コンセンサスH3赤血球凝集素、及び3)インフルエンザB型赤血球凝集素。
いくつかの実施形態において、ワクチンは、以下のような組み合わせを有することができる:
a)インフルエンザウイルスの複数の株に対して、哺乳動物において広範な交差反応性の免疫応答を生じさせることが可能である第1のインフルエンザ核酸配列H1赤血球凝集素のうちの1つ以上は以下から選択される:
以下からなる群から選択される核酸配列:配列番号1、配列番号1に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号1のフラグメント、配列番号1のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号9、配列番号9に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号9のフラグメント、配列番号9のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号19、配列番号19に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号19のフラグメント、配列番号19のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号21、配列番号21に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号21のフラグメント、配列番号21のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号35、配列番号35に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号35のフラグメント、配列番号35のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号2をコードする核酸配列、配列番号2をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号2をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号2をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号10をコードする核酸配列、配列番号10をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号10をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号10をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号20をコードする核酸配列、配列番号20をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号20をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号20をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号22をコードする核酸配列、配列番号22をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号22をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号22をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号36をコードする核酸配列、配列番号36をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号36をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号36をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列。
b)インフルエンザウイルスの複数の株に対して、哺乳動物において広範な交差反応性の免疫応答を生じさせることが可能である第1のインフルエンザ核酸配列H3赤血球凝集素のうちの1つ以上は以下から選択される:
以下からなる群から選択される核酸配列:配列番号23、配列番号23に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号23のフラグメント、配列番号23のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号27、配列番号27に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号27のフラグメント、配列番号27のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号29、配列番号29に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号29のフラグメント、配列番号29のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号37、配列番号37に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号37のフラグメント、配列番号37のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号24をコードする核酸配列、配列番号24をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号24をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号24をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号28をコードする核酸配列、配列番号28をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号28をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号28をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号30をコードする核酸配列、配列番号30をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号30をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号30をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号38をコードする核酸配列、配列番号38をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号38をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号38をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列。
c)インフルエンザウイルスの複数の株に対して、哺乳動物において広範な交差反応性の免疫応答を生じさせることが可能である第1のインフルエンザ核酸配列インフルエンザB型赤血球凝集素のうちの1つ以上は以下から選択される:
以下からなる群から選択される核酸配列:配列番号13、配列番号13に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号13のフラグメント、配列番号13のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号25、配列番号25に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号25のフラグメント、配列番号25のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号31、配列番号31に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号31のフラグメント、配列番号31のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号33、配列番号33に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号33のフラグメント、配列番号33のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号14をコードする核酸配列、配列番号14をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号14をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号14をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号26をコードする核酸配列、配列番号26をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号26をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号26をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号32をコードする核酸配列、配列番号32をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号32をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号32をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号34をコードする核酸配列、配列番号34をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号34をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号34をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列。
いくつかの実施形態において、上記のa)、b)、及びc)に加えて、この組み合わせはまた、インフルエンザウイルスの複数の株に対して、哺乳動物において広範な交差反応性の免疫応答を生じさせることが可能であるインフルエンザ核酸配列H2赤血球凝集素のうちの1つ以上を含むことができ、これは以下から選択される:配列番号6、配列番号6に少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号6のフラグメント;配列番号6のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号7をコードする核酸配列;配列番号7をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列;配列番号7をコードする核酸配列のフラグメント;及び配列番号7をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列。
DNAワクチンは、米国特許第5,593,972号、同第5,739,118号、同第5,817,637号、同第5,830,876号、同第5,962,428号、同第5,981,505号、同第5,580,859号、同第5,703,055号、及び同第5,676,594号に開示され、これらは、参照により本明細書に完全に組み込まれる。DNAワクチンは、それが染色体内に統合することを阻害する、エレメントまたは試薬をさらに含んでもよい。ワクチンは赤血球凝集素抗原のRNAであり得る。RNAワクチンは細胞中に導入することができる。
ワクチンは、上記の遺伝子構築物または抗原を含む組み換えワクチンであり得る。ワクチンはまた、1つ以上のタンパク質サブユニットの形態の1つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原、1つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む1つ以上の死菌インフルエンザ粒子、または1つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む1つ以上の弱毒化インフルエンザ粒子を含み得る。弱毒化ワクチンは、1つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする外来遺伝子を送達するために組み換えベクターを用いるワクチン、弱毒化生菌ワクチン、及び死菌ワクチン、ならびにサブユニットワクチン及び糖タンパク質ワクチンであり得る。外来抗原を送達するために組み換えベクターを使用する弱毒化生ワクチン、サブユニットワクチン、及び糖タンパク質ワクチンは、米国特許第4,510,245号、同第4,797,368号、同第4,722,848号、同第4,790,987号、同第4,920,209号、同第5,017,487号、同第5,077,044号、同第5,110,587号、同第5,112,749号、同第5,174,993号、同第5,223,424号、同第5,225,336号、同第5,240,703号、同第5,242,829号、同第5,294,441号、同第5,294,548号、同第5,310,668号、同第5,387,744号、同第5,389,368号、同第5,424,065号、同第5,451,499号、同第5,453,364号、同第5,462,734号、同第5,470,734号、同第5,474,935号、同第5,482,713号、同第5,591,439号、同第5,643,579号、同第5,650,309号、同第5,698,202号、同第5,955,088号、同第6,034,298号、同第6,042,836号、同第6,156,319号、及び同第6,589,529号に記載され、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。
ワクチンは、世界の特定の地域、例えば、アジアのインフルエンザA型血清型に対するベクター及び/またはタンパク質を含み得る。ワクチンは、現在はヒトに感染するブタ起源のインフルエンザA型血清型に対するものであってよい。ワクチンは、世界の特定の地域のインフルエンザB型に対するベクター及び/またはタンパク質を含み得る。ワクチンは、ヒトに感染するインフルエンザB型に対するものであってよい。ワクチンは、インフルエンザA型及び/またはB型の1つ以上の株に対する1つ以上のベクター及び/または1つ以上のタンパク質を含んでもよい。
提供されるワクチンを使用して、治療的または予防的免疫応答を含む、免疫応答を誘導し得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原に対して、また、インフルエンザウイルスの多種サブタイプに対して幅広く、抗体及び/またはキラーT細胞が生成され得る。そのような抗体及び細胞を単離してもよい。
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤等の機能性分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であってもよく、これには、免疫刺激複合体(ISCOMS)等の界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドAを含むLPS類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレン等の小胞体、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルス性タンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、あるいは他の既知のトランスフェクション促進剤が挙げられる。
トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ−L−グルタミン酸(LGS)を含むポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−L−グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ−L−グルタメートは、6mg/ml未満の濃度で、ワクチン中に存在し得る。トランスフェクション促進剤は、免疫刺激複合体(ISCOMS)等の界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドAを含むLPS類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレン及びスクアレン等の小胞体を含み得、ヒアルロン酸もまた、遺伝子構築物との併用で、投与することができる。いくつかの実施形態において、DNAベクターワクチンまた、脂質、DNAリポソーム混合物(例えば、WO9324640を参照されたい)として、レシチンリポソームもしくは当該技術分野で既知の他のリポソームを含む、リポソーム等のトランスフェクション促進剤、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、またはその他の既知のトランスフェクション促進剤を含んでもよい。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、例えば、ポリ−L−グルタミン酸(LGS)、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は4mg/ml未満、2mg/ml未満、1mg/ml未満、0.750mg/ml未満、0.500mg/ml未満、0.250mg/ml未満、0.100mg/ml未満、0.050mg/ml未満、または0.010mg/ml未満である。
薬学的に許容される賦形剤はアジュバントであり得る。アジュバントは、別のプラスミド中で発現される他の遺伝子であってもよく、あるいはワクチン中で上記プラスミドと組み合わされたタンパク質として送達される。アジュバントは、シグナル配列が欠失したIL−15を含み、任意でIgE由来のシグナルペプチドを含む、α−インターフェロン(IFN−α)、β−インターフェロン(IFN−β)、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM−CSF、上皮成長因子(EGF)、皮膚T細胞誘引ケモカイン(CTACK)、上皮胸腺発現ケモカイン(TECK)、粘膜関連上皮ケモカイン(MEC)、IL−12、IL−15、MHC、CD80、CD86からなる群から選択することができる。アジュバントは、IL−12、IL−15、IL−28、CTACK、TECK、血小板由来成長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM−CSF、上皮成長因子(EGF)、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−12、IL−18、またはその組み合わせであり得る。
有用なアジュバントであり得る他の遺伝子には、MCP−1、MIP−1a、MIP−1p、IL−8、RANTES、L−セレクチン、P−セレクチン、E−セレクチン、CD34、GlyCAM−1、MadCAM−1、LFA−1、VLA−1、Mac−1、pl50.95、PECAM、ICAM−1、ICAM−2、ICAM−3、CD2、LFA−3、M−CSF、G−CSF、IL−4、IL−18の突然変異体形態、CD40、CD40L、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、IL−7、神経成長因子、血管内皮成長因子、Fas、TNF受容体、Flt、Apo−1、p55、WSL−1、DR3、TRAMP、Apo−3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL−R2、TRICK2、DR6、カスパーゼICE、Fos、c−jun、Sp−1、Ap−1、Ap−2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、不活性NIK、SAP K、SAP−1、JNK、インターフェロン応答遺伝子、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL−R3、TRAIL−R4、RANK、RANKリガンド、Ox40、Ox40リガンド、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2、及びそれらの機能性フラグメントが挙げられる。
ワクチンは、1994年4月1日に出願され、参照により完全に組み込まれる米国特許出願第021,579号に記載のような、遺伝子ワクチン促進剤をさらに含んでもよい。
5.送達方法
インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を誘導し得る特に効果的な免疫原とするためのエピトープを含む赤血球凝集素抗原の遺伝子構築物及びタンパク質を提供するための薬学的製剤、好ましくはワクチンを送達する方法を本明細書に提供する。ワクチン送達方法はまたはワクチン接種方法は、治療的及び/または予防的免疫応答を誘導するようになされ得る。ワクチン接種プロセスは、哺乳動物において、2009ブタ起源H1N1等のH1N1血清型、または他の季節性及び/もしくは流行性の種類を含む多種インフルエンザサブタイプに対する免疫応答を生成することができる。ワクチンを個体に送達して、哺乳動物の免疫系の活性を調節し、免疫応答を強化することができる。ワクチンの送達は、細胞内に発現され、細胞表面に送達されると、免疫系によって認識されて、細胞性、体液性、または細胞性かつ体液性の応答を誘導する、核酸分子として、HA抗原をトランスフェクションすることであり得る。ワクチン送達を用いて、本明細書に記載されるワクチンを哺乳動物に投与することによって、複数のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を、哺乳動物において誘導または誘発することができる。
哺乳動物へのワクチン送達後、ベクターが哺乳動物の細胞内に入った後、トランスフェクト細胞は、コンセンサス抗原、好ましくはH1、H2、U2、及びBHAの少なくとも1つを含む、対応するインフルエンザタンパク質を発現及び分泌する。これらの分泌されたタンパク質、または合成抗原は、免疫系によって異物として認識されることになり、それによって、免疫応答を開始することになり、これには、この抗原に対して作製される抗体及びこの抗原に特異的なT細胞応答が含まれ得る。いくつかの実施例において、本明細書に記載のワクチンをワクチン接種された哺乳動物は、準備刺激された免疫系を有することになり、インフルエンザウイルス株で暴露されると、準備刺激された免疫系は、体液性、細胞性、またはその両方を通じてかに関係なく、それ以降のインフルエンザウイルスの急速な排除を可能にするであろう。ワクチンを個体に送達して、個体の免疫系の活性を調節し、それによって、免疫応答を強化することができる。
ワクチンは、DNAワクチンの形態で送達することができ、DNAワクチンの送達方法は、米国特許第4,945,050号及び同第5,036,006号に記載され、これらはいずれも参照により完全に組み込まれる。
ワクチンは、哺乳動物において免疫応答を誘発するように哺乳動物に投与され得る。哺乳動物はヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。
a.他の抗原とアジュバントとの組み合わせ
本明細書に記載の薬学的組成物、好ましくはワクチンは、インフルエンザA型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、インフルエンザB型赤血球凝集素、及びノイラミニダーゼをコードする1つ以上の他のインフルエンザタンパク質または遺伝子と組み合わせて投与され得る。ワクチンは、アジュバントをコードする遺伝子またはタンパク質と組み合わせて投与され得、アジュバントとしては以下を挙げることができる:α−インターフェロン(IFN−α)、β−インターフェロン(IFN−β)、γ−インターフェロン、IL−12、IL−15、IL−21、IL−23、IL−28、IL−33、CTACK、TECK、血小板由来成長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM−CSF、上皮成長因子(EGF)、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−18、MCP−1、MIP−1a、MIP−1p、IL−8、RANTES、L−セレクチン、P−セレクチン、E−セレクチン、CD34、GlyCAM−1、MadCAM−1、LFA−1、VLA−1、Mac−1、pl50.95、PECAM、ICAM−1、ICAM−2、ICAM−3、CD2、LFA−3、M−CSF、G−CSF、IL−4、変異体形態のIL−18、CD40、CD40L、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、IL−7、神経成長因子、血管内皮成長因子、Fas、TNF受容体、Flt、Apo−1、p55、WSL−1、DR3、TRAMP、Apo−3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL−R2、TRICK2、DR6、カスパーゼICE、Fos、c−jun、Sp−1、Ap−1、Ap−2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、不活性NIK、SAP K、SAP−1、JNK、インターフェロン応答遺伝子、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL−R3、TRAIL−R4、RANK、RANK リガンド、Ox40、Ox40 リガンド、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、もしくはTAP2、またはそれらの機能性フラグメント。
b.投与経路
ワクチンは、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入経由、口腔投与経由、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、及び関節内、またはそれらの組み合わせを含む種々の経路で投与され得る。獣医学的用途については、本組成物を、通常の獣医学診療に従って、好適に許容される剤形として、投与することができる。獣医師であれば、特定の動物に対して最も適切な投与の投薬レジメン及び経路を容易に判定することができる。ワクチンは、従来型のシリンジ、無針注射デバイス、「微粒子遺伝子銃(microprojectile bombardment gone gun)」、または電気穿孔(「EP」)、「流体力学法」、もしくは超音波等の他の物理的方法によって、投与することができる。
ワクチンのベクターは、インビボ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルス、及び組み換えワクチン等の組み換えベクターあり及びなしでのDNA注射(DNAワクチン接種とも呼ばれる)を含む、いくつかの周知の技術によって、哺乳動物に送達することができる。HA抗原は、DNA注射を介して、インビボ電気穿孔を伴って、送達されてもよい。
c.電気穿孔
ワクチンのプラスミドの電気穿孔を介したワクチンの投与は、細胞膜に可逆孔の形成をもたらすのに効果的なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することが可能な電気穿孔デバイスを使用して、達成することができ、好ましくは、エネルギーパルスは、使用者によって入力された事前設定電流に類似の一定電流である。電気穿孔デバイスは、電気穿孔部品と、電極アセンブリまたはハンドルアセンブリと、を備え得る。電気穿孔部品は、制御器、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形記録装置、入力エレメント、状態報告エレメント、通信ポート、メモリー部品、電源、及び電源スイッチを含む、電気穿孔デバイスの種々のエレメントのうちの1つ以上を含み、それを組み込むことができる。電気穿孔は、インビボ電気穿孔デバイス、例えば、CELLECTRA(登録商標)EPシステム(VGX Pharmaceuticals,Blue Bell,PA)またはElgenエレクトロポレーター(Genetronics,San Diego,CA)を使用して達成し、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを促進することができる。
電気穿孔部品は、電気穿孔デバイスの1つのエレメントとして機能してよく、他のエレメントは電気穿孔部品と通信する別個のエレメント(または部品)である。電気穿孔部品は、電気穿孔デバイスの2つ以上のエレメントとして機能してよく、電気穿孔部品とは別個の電気穿孔デバイスのさらなる別のエレメントと通信してよい。1つの電気機械的または機械的デバイスの一部として存在する電気穿孔デバイスのエレメントは、1つのデバイスとしてまたは互いに通信する別個のエレメントとして機能し得るエレメントに限定されなくてもよい。電気穿孔部品は、所望の組織において一定電流を生成するエネルギーパルスを送達することができることもあり、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的に配置された複数の電極を有する電極アレイを含んでよく、電極アセンブリは、電気穿孔部品からのエネルギーパルスを受け取り、電極を介してそれを所望の組織に送達する。複数の電極の少なくとも1つは、エネルギーパルス送出中、中性であり、所望の組織におけるインピーダンスを測定し、電気穿孔部品にインピーダンスを伝える。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受けることができ、電気穿孔部品により送達されるエネルギーパルスを調整して一定電流を維持することができる。
複数の電極がエネルギーパルスを分散パターンで送達してもよい。複数の電極は、使用者によって電気穿孔部品に入力されたプログラム配列下において電極の制御によりエネルギーパルスを分散パターンで送達してもよい。プログラム配列は、配列中に送達される複数のパルスを含み得、複数のパルスの各パルスは、電極の1つがインピーダンスを測定する中性電極である少なくとも2つの活性電極によって送達され、複数のパルスの次のパルスは、電極のうちの1つがインピーダンスを測定する中性電極である少なくとも2つの活性電極のうちの異なる1つによって送達される。
フィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアによって実施され得る。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって実施され得る。フィードバックは、50μs、20μs、10μs、または1μs毎に起こるが、好ましくはリアルタイムフィードバックまたは即時的(すなわち、応答時間を測定するための利用可能な技術による決定で実質的に即時的)である。中性電極は、所望の組織におけるインピーダンスを測定することができ、インピーダンスをフィードバック機構へと伝達し、フィードバック機構はこのインピーダンスに応答して、予め設定された電流に近い値に一定電流を維持するようにエネルギーのパルスを調整する。フィードバック機構は、エネルギーパルスの送達中、一定電流を連続的かつ即時的に維持し得る。
本発明のDNAワクチンの送達を促進することができる電気穿孔デバイス及び電気穿孔法の例には、Draghia−Akli,et al.による米国特許第7,245,963号、Smith,et al.により提出された米国特許出願公開第2005/0052630号に記載のものが含まれ、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。DNAワクチンの送達を促進するために使用可能な他の電気穿孔デバイス及び電気穿孔法には、2007年10月17日に出願された同時係属中でありかつ共同で所有される米国特許出願第11/874072号が挙げられ、これは、2006年10月17日に出願された米国仮出願第60/852,149号及び2007年10月10日に出願された同第60/978,982号(これらの全ては、それらの全体が本明細書に組み込まれる)に対して米国特許法第119条(e)に基づいて利益を主張する。
Draghia−Akli,et al.による米国特許第7,245,963号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのモジュール電極システム及びそれの使用について記載している。モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下注射針、プログラム可能な一定電極パルス制御器から複数の針電極に導電性接続を提供する電気コネクタ、及び電源を備え得る。操作者は、支持構造体に載置された複数の針電極を把持し、それらを体内または植物内の選択された組織へしっかりと挿入することができる。次いで、皮下注射針により、選択された組織中に生体分子が送達される。プログラム可能な一定電流パルス制御器が作動され、一定電流電気パルスが複数の針電極に印加される。印加された一定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞中への生体分子の導入を促進にする。米国特許第7,245,963号の内容全体を参照により本明細書に組み込まれる。
Smith,et al.によって出願された米国特許出願公開第2005/0052630号は、体内または植物内の選択された組織の細胞内への生体分子の導入を効果的に促進するために使用可能な電気穿孔デバイスについて記載している。この電気穿孔デバイスは、その操作がソフトウェアまたはファームウェアによって指定される、動電デバイス(「EKDデバイス」)を含む。EKDデバイスは、使用者制御及びパルスパラメーターの入力に基づいて、アレイの電極間に、一連のプログラム可能な一定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存及び取得を可能にする。電気穿孔デバイスはまた、一連の針電極、注射針用の中央注射チャネル、及び取り外し可能なガイドディスクを有する、交換可能な電極ディスクを備える。米国特許出願公開第2005/0052630号の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
米国特許第7,245,963号及び米国特許出願公開第2005/0052630号に記載される電極アレイ及び方法は、筋肉等の組織だけでなく、他の組織または器官に深く浸透するように適合させることができる。電極アレイの構成により、(選択された生体分子を送達するための)注射針も標的臓器中に完全に挿入され、電極によって予め輪郭付けられた領域で、注入物が標的組織に垂直に投与される。米国特許第7,245,963号及び米国特許出願公開第2005/005263号に記載されている電極は、好ましくは長さ20mm、21ゲージである。
さらに、電気穿孔デバイス及びその使用を組み込むいくつかの実施形態に企図される、次の特許に記載されるものである電気穿孔デバイスが存在する:1993年12月28日に発行された米国特許第5,273,525号、2000年8月29日に発行された米国特許第6,110,161号、2001年7月17日に発行された同第6,261,281号、及び2005年10月25日に発行された同第6,958,060号、ならびに2005年9月6日に発行された米国特許第6,939,862号。さらに、あらゆる種類のデバイスを使用してDNAの送達を考察する、2004年2月24日に発行された米国特許第6,697,669号に提供される主題を取り扱う特許、及びDNAの注射方法に注目した、2008年2月5日に発行された米国特許第7,328,064号が、本明細書に企図される。上記の特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
d.ワクチンを調製する方法
本明細書に記載のDNAワクチンを含むDNAプラスミドを調製するための方法を本明細書に提供する。哺乳動物の発現プラスミドへの最終サブクローニング後、DNAプラスミドは、当該技術分野で既知の方法を使用して、細胞培養物を大規模な発酵タンクに植え付けるために使用することができる。
本発明のEPデバイスで使用するためのDNAプラスミドは、既知のデバイス及び技術との組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは、認可され、2007年5月23日付で出願された同時係属中の米国仮出願第60/939,792号に記載されている最適化されたプラスミド製造技術を用いて製造される。いくつかの実施形態において、これらの研究で使用されるDNAプラスミドは、10mg/ml以上の濃度で製剤化することができる。製造技術はまた、米国特許出願第60/939792号に加えて、認可された特許である2007年7月3日に発行された米国特許第7,238,522号に記載のものを含む、当業者に一般的に既知の種々のデバイスまたは手順を含むか、またはそれらを組み込む。上で参照された出願及び特許である米国特許出願第60/939,792号及び米国特許第7,238,522号は、それぞれ、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
実施例
本発明を、以下の実施例でさらに説明する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、単に説明のために記載されることを理解されたい。上述の説明及びこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨及び範囲を逸脱しない範囲で、種々の用途及び状況に適合するように、本発明に種々の変更及び修正を行うことができる。したがって、本明細書に示され、説明されるものに加えて、本発明の種々の修正は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修正も添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
実施例1
pGX2009(pH1HA09)−2009H1N1インフルエンザ(ブタインフルエンザ)赤血球凝集素抗原をコードするプラスミド
pGX2009(H1HA09)の骨格は、サイトメガロウイルス最初期(CMV)プロモーターの制御下にある改変発現ベクターpVAX1(Invitrogen、Carlsbad,CA)である。元のpVAX1をInvitrogenから購入し(カタログ番号V260−20)、−20℃に維持した。前述の通り、配列分析により、pGX2009の骨格として使用するpVAX1の配列とInvitrogenから入手可能なpVAX1配列との間の差を明らかにした。差は前述の通りである。
プラスミドpGX2009(pH1HA09ともいう)は、コンセンサス2009H1N1インフルエンザ(ブタインフルエンザ)赤血球凝集素分子をコードする核酸配列を含む。コンセンサス配列を生成するために使用した79個の一次配列をインフルエンザ配列データベースから選択した。
種々のインフルエンザA型赤血球凝集素H1タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及びヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の寄託番号はGenBankデータベースにおける以下の寄託番号に対応する。括弧内にない寄託番号はヌクレオチド配列及びそれらによりコードされるアミノ酸配列のさらなる一覧を開示している。括弧内の寄託番号は、GenBankタンパク質データベース中の対応するアミノ酸配列のエントリーのものである。
寄託番号は以下の通りである:GQ323579.1(ACS72657.1)、GQ323564.1(ACS72654.1)、GQ323551.1(ACS72652.1)、GQ323530.1(ACS72651.1)、GQ323520.1(ACS72650.1)、GQ323495.1(ACS72648.1)、GQ323489.1(ACS72647.1)、GQ323486.1(ACS72646.1)、GQ323483.1(ACS72645.1)、GQ323455.1(ACS72641.1)、GQ323451.1(ACS72640.1)、GQ323443.1(ACS72638.1)、GQ293077.1(ACS68822.1)、GQ288372.1(ACS54301.1)、GQ287625.1(ACS54262.1)、GQ287627.1(ACS54263.1)、GQ287623.1(ACS54261.1)、GQ287621.1(ACS54260.1)、GQ286175.1(ACS54258.1)、GQ283488.1(ACS50088.1)、GQ280797.1(ACS45035.1)、GQ280624.1(ACS45017.1)、GQ280121.1(ACS45189.1)、GQ261277.1(ACS34968.1)、GQ253498.1(ACS27787.1)、GQ323470.1(ACS72643.1)、GQ253492.1(ACS27780.1)、FJ981613.1(ACQ55359.1)、FJ971076.1(ACP52565.1)、FJ969540.1(ACP44189.1)、FJ969511.1(ACP44150.1)、FJ969509.1(ACP44147.1)、GQ255900.1(ACS27774.1)、GQ255901.1(ACS27775.1)、FJ966974.1(ACP41953.1)、GQ261275.1(ACS34967.1)、FJ966960.1(ACP41935.1)、FJ966952.1(ACP41926.1)、FJ966082.1(ACP41105.1)、GQ255897.1(ACS27770.1)、CY041645.1(ACS27249.1)、CY041637.1(ACS27239.1)、CY041629(ACS27229.1)、GQ323446.1(ACS72639.1)、CY041597.1(ACS27189.1)、CY041581.1(ACS14726.1)、CY040653.1(ACS14666.1)、CY041573.1(ACS14716.1)、CY041565.1(ACS14706.1)、CY041541.1(ACS14676.1)、GQ258462.1(ACS34667.1)、CY041557.1(ACS14696.1)、CY041549.1(ACS14686.1)、GQ283484.1(ACS50084.1)、GQ283493.1(ACS50095.1)、GQ303340.1(ACS71656.1)、GQ287619.1(ACS54259.1)、GQ267839.1(ACS36632.1)、GQ268003.1(ACS36645.1)、CY041621.1(ACS27219.1)、CY041613.1(ACS27209.1)、CY041605.1(ACS27199.1)、FJ966959.1(ACP41934.1)、FJ966982.1(ACP41963.1)、CY039527.2(ACQ45338.1)、FJ981612.1(ACQ55358.1)、FJ981615.1(ACQ55361.1)、FJ982430.1(ACQ59195.1)、FJ998208.1(ACQ73386.1)、GQ259909.1(ACS34705.1)、GQ261272.1(ACS34966.1)、GQ287621.1(ACS54260.1)、GQ290059.1(ACS66821.1)、GQ323464.1(ACS72642.1)、GQ323473.1(ACS72644.1)、GQ323509.1(ACS72649.1)、GQ323560.1(ACS72653.1)、GQ323574.1(ACS72655.1)、及びGQ323576.1(ACS72656.1)。アミノ酸配列をNCBI配列データベースからダウンロードし、アラインメント及びコンセンサス配列をClustal Xを用いて生成した。発現を促進するために、非常に効率的なリーダー配列であるIgEリーダーを開始コドンの上流にインフレームで融合させた。より高レベルで発現させるために、この融合遺伝子のコドン使用頻度をヒト遺伝子のコドン偏位に適合させた。さらに、RNAの最適化も行った:GC含量が非常に高い(>80%)または非常に低い(<30%)領域及び内部TATAボックス、カイ部位、リボソーム進入部位等のシス作用性配列モチーフを避けた。全体配列はGeneart(Regensburg,Germany)で合成により生成された。改変された合成H1HA09遺伝子は、長さが1818bpであり(配列番号3)、Geneartにより、BamH1及びXhoIの部位でpVAX1にクローニングされた(図2)。
実施例2
HS09インフルエンザ(pGX2009)免疫化したフェレット
インフルエンザの好ましいモデルであるフェレットを用いて実験を行った。フェレットを、プラスミドpGX2009を用いて免疫化した(挿入部HS09(配列番号1)を含む配列番号5)。
動物:4群×5頭/群及び4頭の1対照群=合計24フェレット(雄)
期間:18週間(暴露含む)
用量:0.2mgプラスミド
プロトコル概要:フェレットをDNAワクチン群に無作為に割り振った。動物を実験0日目、28日目、及び56日目に免疫化した。承認されている麻酔プロトコルに従い、ケタミン/ミダゾラムカクテル、イソフルラン、または同等物を用いて、動物に麻酔をかけ、インフルエンザDNAワクチンの組み合わせを用いて筋肉内(IM)にワクチン接種を行った。第1群及び第2群は、CELLECTRA(登録商標)適応一定電流電気穿孔(EP)デバイスを0.5Amp、52ミリ秒パルス、パルス間0.2秒、発火遅延4秒、合計3パルスで用いて、直ちに電気穿孔した。対照動物は未処置対照とした(プラスミドなし、EPなし)。フェレットをケージ中で麻酔から回復させ、24時間注意深く監視して確実に完全に回復させた。
餌及び水は実験期間中自由に摂取させた。84日目に、1mlのMX10(A/メキシコ/InDRE4487/2009、5×105PFU/ml)を用いて鼻腔内感染により動物を暴露した。確立及び承認されたスコアシートを用いて、動物の臨床徴候(体重、温度等)を毎日監視した。感染後1、3、6、9、及び15日目(dpi)に、鼻洗浄物及び直腸スワブを回収した。肺を15日目に回収した。サンプルを適宜、リアルタイムPCRによりウイルス負荷を調べるためのRNAlater、感染性ウイルスを調べるための培地(TCDI50)、及び組織学的検査のためのホルマリンに保管した。
HAI力価
フェレットを放血させ、血清サンプルを直ちにドライアイス上に保存し、処理のためにBIOQUAL(Rockville、MD)に発送した。血清を3部の酵素で1部の血清を希釈することによって受容体破棄酵素を処理し、37℃での水浴で一晩インキュベートした。酵素を30分間56℃でのインキュベーションによって不活性化し、続いて、1/10の最終希釈のために6部のリン酸緩衝食塩水を添加した。HAI試験をV底96−ウェルマイクロ力価プレート内でウイルスの4つの赤血球凝集ユニット及び1%の赤血球を使用して実施した。HAI試験のために使用されるウイルス(H1N1/メキシコ/InDRE4487/2009株)は、CDCのインフルエンザ分岐から得られる。図4は、免疫化(3回免疫化)したフェレットの血清を用いて行った赤血球凝集抑制試験を示す。力価が、>1:40であるものを「防御」と見なす。点線は1:40のマークを示す。3回免疫化後は全ての動物が1:40のマークを超えていた。
暴露研究
図5は、免疫化したフェレット及び免疫されていないフェレットを新規なH1N1株MX10(A/メキシコ/InDRE4487/2009)に暴露した結果を示す。免疫化されたフェレットは全て生存したが、未処置フェレットは15日の期間内に75%が死亡した。
実施例3
H1赤血球凝集素組み合わせ研究
種々の動物(マウス、モルモット、及びフェレット)を使用して実験を行った。動物は、骨格pVAX1を有するプラスミド構築物、異なる挿入を有する各構築物を使用して免疫化した。
図7A〜G、8A〜C、9A〜B、10A〜B、11A〜Cにおいて:未処置(pVAX1のみ)、H1U1(配列番号35挿入部を有するpVAX1)、HS09(配列番号5)、ConBris(またはH1Bris)(配列番号19挿入部を有するpVAX1)、ConTT(またはH1TT)(配列番号21挿入部を有するpVAX1)、
図13A〜F、14A〜C、15A〜D、16A〜C、17A〜Cにおいて:未処置(pVAX1のみ)、BHA−1(配列番号13挿入部を有するpVAX1)、BHA−2(配列番号25挿入部を有するpVAX1)、BHA−3(配列番号31挿入部を有するpVAX1)、BHA−4(配列番号33挿入部を有するpVAX1)。
図19A〜E、20A〜Fにおいて、未処置(pVAX1のみ)、H3HA−1(配列番号37挿入部を有するpVAX1)、H3HA−2(配列番号23挿入部を有するpVAX1)、H3HA−3(配列番号27挿入部を有するpVAX1)、H3HA−4(配列番号29挿入部を有するpVAX1)。
用量:0.2mgプラスミド
プロトコル要約:動物をDNAワクチン群に無作為に割り振った。動物を実験0日目、28日目、及び56日目に免疫化した。承認されている麻酔プロトコルに従い、ケタミン/ミダゾラムカクテル、イソフルラン、または同等物を用いて、動物に麻酔をかけ、インフルエンザDNAワクチンの組み合わせを用いて筋肉内(IM)にワクチン接種を行った。第1群及び第2群を、CELLECTRA適応一定電流電気穿孔(EP)デバイス(Inovio Pharmaceuticals、Blue Bell、PA)を用いて、0.5Amp、52ミリ秒パルス、パルス間0.2秒、発火遅延4秒、合計3パルスで、直ちに電気穿孔した。対照動物は未処置対照とした(プラスミドなし、EPなし)。この動物をケージ中で麻酔から回復させ、24時間注意深く監視して確実に完全に回復させた。
HAI試験
動物を放血させ、血清サンプルを直ちにドライアイス上に保存し、処理のためにBIOQUAL(Rockville、MD)に発送した。血清を3部の酵素で1部の血清を希釈することによって受容体破棄酵素を処理し、37℃での水浴で一晩インキュベートした。酵素を30分間56℃でのインキュベーションによって不活性化し、続いて、1/10の最終希釈のために6部のリン酸緩衝食塩水を添加した。HAI試験をV底96−ウェルマイクロ力価プレート内でウイルスの4つの赤血球凝集ユニット及び1%の赤血球を使用して実施した。HAI試験のために使用されるウイルス(H1N1/メキシコ/2009株)は、CDCのインフルエンザ分岐から得られる。
H1研究:
コンボ(4つのH1抗原全て)をワクチン接種されたマウスが10株のうち9株に対して防御力価を示したことを実験は示した(図7A〜7F、及び図8A〜C)。これは、株全体にわたる堅牢な交差反応性を示す。同様に、コンボを接種されたモルモットは10株全てに対して防御力価を示したことを実験は示した(図9A〜B及び10A〜Bを参照されたい)。
インフルエンザB型研究:
コンボ(BHA−1及びBHA−2抗原の両方)でワクチン接種されたマウスが9株のうちの4株に対して防御力価を示した(図13A〜13C及び図14C)が、一方で2株が境界1:40を示したことを実験は示した(図13D及び図14A)。個体の抗原は、9株のうちの4株(BHA−1)及び9株のうちの3株(BHA−2)に対して防御力価を示した。同様に、コンボを接種されたモルモットは10株全てに対して防御力価を示したことを実験は示した(図9A〜B及び10A〜Bを参照されたい)。
コンボ(BHA−1及びBHA−2抗原の両方)でワクチン接種されたモルモットが10株のうちの10株全てに対して防御力価を示したことを実験は示した(投与後3「PD3」を参照)。一方で、単独の抗原での免疫化はこのような交差防御を提供せず、BHA−1が10株のうちの7株に対して唯一の防御力価を提供する(図15A〜D及び図16A〜C)。
H3研究
コンボ(H3HA−1及びH3HA−2抗原の両方)でワクチン接種されたマウスが11株のうちの4株(図19A〜D)に対して防御力価、2株に対して近い防御力価を示したことを実験は示した(図19E及び図20F)。一方で、単独の抗原は、H3HA−1(図19A〜D)の場合に11株のうちの4株に対して交差防御を示すが、HAI力価は残りの株のいずれにおいても呈されなかった。コンボH3混合は、単独の1つのH3抗原よりも若干広い交差防御を示した。
暴露研究
餌及び水は実験期間中自由に摂取させた。84日目に、1mlのMX10(A/メキシコ/2009、5×105 PFU/ml)を用いて鼻腔内感染によりフェレットを暴露した。確立及び承認されたスコアシートを用いて、動物の臨床徴候(体重、温度等)を毎日監視した。感染後1、3、6、9、及び15日目(dpi)に、鼻洗浄物及び直腸スワブを回収した。肺を15日目に回収した。サンプルを適宜、リアルタイムPCRによりウイルス負荷を調べるためのRNAlater、感染性ウイルスを調べるための培地(TCDI50)、及び組織学的検査のためのホルマリンに保管した。
ワクチン接種されたH1HA−暴露
HS09及びH1Uをワクチン接種されたフェレットは、5匹のフェレット全てが感染後14日間生き延びたときに免疫防御を示したが、一方で未処置の5匹のうち1匹のみが生き残った。図11A〜Cを参照されたい。



  1. 多種コンセンサスサブタイプワクチンであって、種々のインフルエンザ株に対する交差反応性を提供し、かつ少なくとも1つのコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む、ワクチン。

  2. 前記コンセンサス赤血球凝集素抗原が、H1赤血球凝集素、H2赤血球凝集素、H3赤血球凝集素、インフルエンザB型赤血球凝集素、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載のワクチン。

  3. 前記H1赤血球凝集素が、HS09、H1Bris、H1TT、H1U、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項2に記載のワクチン。

  4. 前記H3赤血球凝集素が、H3HA−1、H3HA−2、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項2に記載のワクチン。

  5. 前記インフルエンザB型赤血球凝集素が、BHA−1、BHA−2、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項2に記載のワクチン。

  6. HS09が、配列番号2をコードする核酸配列、配列番号2をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号2をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号2をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
    H1Brisが、配列番号20をコードする核酸配列、配列番号20をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号20をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号20をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
    H1TTが、配列番号22をコードする核酸配列、配列番号22をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号22をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号22をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
    H1Uが、配列番号36をコードする核酸配列、配列番号36をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号36をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号36をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項3に記載のワクチン。

  7. HS09が、配列番号1、配列番号1に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号1のフラグメント、配列番号1のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
    H1Brisが、配列番号19、配列番号19に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号19のフラグメント、配列番号19のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
    H1TTが、配列番号21、配列番号21に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号21のフラグメント、配列番号21のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
    H1Uが、配列番号35、配列番号35に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号35のフラグメント、配列番号35のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項3に記載のワクチン。

  8. H3HA−1が、配列番号38をコードする核酸配列、配列番号38をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号38をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号38をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
    H3HA−2が、配列番号24をコードする核酸配列、配列番号24をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号24をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号24をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項4に記載のワクチン。

  9. H3HA−1が、配列番号37、配列番号37に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号37のフラグメント、配列番号37のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
    H3HA−2が、配列番号23、配列番号23に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号23のフラグメント、配列番号23のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項4に記載のワクチン。

  10. BHA−1が、配列番号14をコードする核酸配列、配列番号14をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号14をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号14をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
    BHA−2が、配列番号26をコードする核酸配列、配列番号26をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号26をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号26をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項5に記載のワクチン。

  11. BHA−1が、配列番号13、配列番号13に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号13のフラグメント、配列番号13のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
    BHA−2が、配列番号25、配列番号25に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号25のフラグメント、配列番号25のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項5に記載のワクチン。

  12. 哺乳動物における種々のインフルエンザ株に対する交差反応性の誘導方法であって、それを必要とする前記哺乳動物に請求項1〜11のいずれか一項に記載のワクチンを投与することを含む、方法。

  13. 前記コンセンサス赤血球凝集素抗原の各々が前記哺乳動物に別々に投与される、請求項12に記載の方法。

  14. 前記コンセンサス赤血球凝集素抗原の各々が前記哺乳動物に同時に投与される、請求項12に記載の方法。

  15. 単離された核酸分子であって、
    配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸配列、配列番号20のアミノ酸配列をコードする核酸配列、配列番号22のアミノ酸配列をコードする核酸配列、配列番号36のアミノ酸配列をコードする核酸配列、配列番号38のアミノ酸配列をコードする核酸配列、配列番号24のアミノ酸配列をコードする核酸配列、配列番号14のアミノ酸配列をコードする核酸配列、配列番号26のアミノ酸配列をコードする核酸配列、
    配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号20のアミノ酸配列をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号22のアミノ酸配列をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号36のアミノ酸配列をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号38のアミノ酸配列をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号24のアミノ酸配列をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号14のアミノ酸配列をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号26のアミノ酸配列をコードする核酸配列に少なくとも95%相同な核酸配列、
    配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号20のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号22のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号36のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号38のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号24のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号14のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号26のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメント、
    配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号20のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号22のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号36のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号38のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号24のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号14のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号26のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される1つ以上の核酸配列を含む、単離された核酸分子。

  16. 単離された核酸分子であって、
    配列番号1、配列番号19、配列番号21、配列番号35、配列番号37、配列番号23、配列番号13、配列番号25、
    配列番号1に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号19に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号21に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号35に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号37に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号23に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号13に少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号25に少なくとも95%相同な核酸配列、
    配列番号1のフラグメント、配列番号19のフラグメント、配列番号21のフラグメント、配列番号35のフラグメント、配列番号37のフラグメント、配列番号23のフラグメント、配列番号13のフラグメント、配列番号25のフラグメント、
    配列番号1のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号19のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号21のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号35のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号37のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号23のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号13のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列、配列番号25のフラグメントに少なくとも95%相同な核酸配列からなる群から選択される1つ以上の核酸配列を含む、単離された核酸分子。

  17. 調節エレメントに操作可能に連結された、請求項15〜16のいずれか一項に記載の核酸配列を含む発現ベクター。

  18. 第1及び第2の核酸配列を含む組成物であって、前記第1の核酸配列が請求項15に記載の配列を含み、
    前記第2の核酸配列が、インフルエンザA型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、インフルエンザB型赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、及びそれらのフラグメントのうちの1つ以上からなる群から選択されるタンパク質をコードする1つ以上の核酸配列を含む、組成物。

  19. 第1及び第2の核酸配列を含む組成物であって、前記第1の核酸配列が請求項16に記載の配列を含み、
    前記第2の核酸配列が、インフルエンザA型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、インフルエンザB型赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、及びそれらのフラグメントのうちの1つ以上からなる群から選択されるタンパク質をコードする1つ以上の核酸配列を含む、組成物。

  20. 哺乳動物の免疫応答の誘導方法であって、前記哺乳動物に請求項15〜19のいずれか一項に記載の核酸配列を投与することを含む、方法。

 

 

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