CFTRmRNA組成物ならびに関連する方法及び使用

著者らは特許

A61K9/0012 - エアゾール;泡沫剤
A61K9/127 - リポゾーム
A61K9/51 - ナノカプセル
A61K31/7105 - 天然のリボ核酸,すなわちアデニン,グアニン,シトシンまたはウラシルに結合したリボースのみを含み,3’−5’ホスホジエステル結合を持つもの
A61K31/7115 - 修飾塩基,すなわちアデニン,グアニン,シトシン,ウラシル又はチミン以外,を持つ核酸又はオリゴヌクレオチド
A61K31/713 - 2本鎖の核酸またはオリゴヌクレオチド
A61K47/00 - 使用する不活性成分,例.担体または不活性添加剤,に特徴のある医薬品製剤;活性成分と化学結合した標的剤または修飾剤
A61K48/00 - 遺伝子疾病を治療するために生体の細胞内に挿入する遺伝子物質を含有する医療用製剤;遺伝子治療
C07H21/02 - 糖類基としてリボシルを有するもの
C07K14/47 - 哺乳動物から
C07K14/705 - レセプター;細胞表面抗原;細胞表面決定因子
C12 - 生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学
C12N9/14 - 加水分解酵素(3.)
C12N15/63 - ベクターを用いた外来遺伝物質の導入;ベクター;そのための宿主の使用;発現の制御
C12N15/88 - マイクロカプセル化を用いるもの,例.リポソーム小胞を用いるもの

の所有者の特許 JP2016517437:

シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド
エスリス ゲーエムベーハーethris GmbH

 

哺乳動物の肺における誘導を含む、CFTR発現の誘導のためのCFTR mRNAの材料、製剤、産生方法、及び送達方法が提供される。本発明は、嚢胞性線維症を治療するために特に有用である。本発明は、部分的には、CFTR mRNA及び非自然発生的CFTR mRNAの製剤の開発、ならびにインビボの機能的CFTR発現を誘導し得るそれらの投与方法に基づく。本発明に従う組成物、方法、及び使用は、嚢胞性線維症の有効な治療に好適な好ましい安全性プロファイルとともに、大型哺乳動物の肺におけるCFTR発現を提供し得る。

 

 

関連出願の相互参照
本出願は、2013年3月14日出願の米国仮出願第61/783,663号の優先権を主張するものであり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、嚢胞性線維症膜貫通制御因子(CFTR)のmRNA組成物、その用途、ならびにその作製及び使用方法に関する。
嚢胞性線維症は、上皮細胞中の複数の他のイオンチャネル及び輸送系の制御に関与すると考えられる塩素イオンチャネルをコードする、CFTR遺伝子の変異に起因する常染色体性遺伝性障害である。CFTRの機能の損失は、慢性肺疾患、異常な粘液産生、及び劇的に低減された平均余命をもたらす。一般的にはRowe et al.,New Engl.J.Med.352,1992−2001(2005)を参照されたい。
1989年におけるCFTR遺伝子のクローニングにも関わらず、嚢胞性線維症の治療のためのCFTRを置換する有効な療法は未だ開発されていない。文献は、肺におけるCFTRの発現を誘導する試みにおいて遭遇する多数の難点を記述してきた。例えば、CFTR DNAを含むウイルスベクターは免疫応答を誘発し、CF症状が投与後に持続した。Conese et al.,J.Cyst.Fibros.10 Suppl 2,S114−28(2011)、Rosenecker et al.,Curr.Opin.Mol.Ther.8,439−45(2006)。CFTRのDNAを含むDNAの非ウイルス性送達も、免疫応答を誘発すると報告されてきた。Alton et al.,Lancet 353,947−54(1999)、Rosenecker et al.,J Gene Med.5,49−60(2003)。さらに、非ウイルス性DNAベクターは、核膜孔複合体の機構が、転写が起こるであろう核内にDNAを通常は移入しないという追加の問題に遭遇する。Pearson,Nature 460,164−69(2009)。
肺におけるCFTR発現を誘導するに当たっての難点の別の源は、肺環境自体である。肺胞界面活性物質は、Lipofectamine(DOSPA:DOPE)などのカチオン性脂質移動ビヒクルのトランスフェクション効率を低減させることが報告されてきた。
Ernst et al.,J.Gene Med.1,331−40(1999)。また、上記のRoseneckerらは、2003年に、ポリマー媒介性または脂質媒介性のトランスフェクションのいずれかを妨害し得る、気道表面の液体中に存在する複数の阻害性構成要素を特定した。伝令RNA療法は、治療的または補充タンパク質の発現を誘導するための一般的な手法として提案されてきた。タンパク質産生の手段としての、宿主への伝令RNA(mRNA)の導入という概念は、以前に報告されている(Yamamoto,A.et al.Eur.J.Pharm.2009,71,484−489、Debus,H.et al.J.Control Rel.2010,148,334−343)。しかしながら、ある特定のリポプレックス製剤を使用するmRNA送達について、明らかな肺特異的な難点が報告されてきた。例えば、mRNAまたはDNAを担持するリポプレックスのインビトロ及びインビボ性能の比較は、mRNA組成物が培養細胞中でより高い発現をもたらしたにも関わらず、マウス肺に鼻腔内投与されたとき、DNA組成物でのみ測定可能な発現が検出されたことを明らかにした。Andries et al.,Mol.Pharmaceut.9,2136−45(2012)。
CFTRは、ホタルルシフェラーゼ(FFL)などのモデルまたはレポーター遺伝子に対して比較的大きい遺伝子であることにも注目すべきである。野生型CFTRコード配列(配列番号2)及びFFLコード配列(配列番号7)の長さを比較されたい。長さの差は、ある状況下では安定性に、ひいては、任意の所定の用量のmRNAがタンパク質発現を生み出すかどうか、そしてそれが生み出すタンパク質発現の量に、影響し得る。さらに、mRNAのインビトロ合成は、正常な細胞のmRNA、及び望ましくない汚染物質を構成する他の細胞の構成要素の非存在のため細胞による合成より一般的に好ましいが、CFTR mRNAなどの長いコード配列を有するmRNAのインビトロ合成は、FFLなどの比較的短いコード配列を有するmRNAのインビトロ合成よりも、達成が実質的に困難である。
PCT特許公開第WO2007/024708号ならびに米国特許公開第2010/0203627号及び同第2011/0035819号は、CFTR mRNAの治療的投与を記述するが、CFTR mRNAの投与後の肺における機能的CFTRの産生の実践に対する実証された低減、または、インビトロ転写CFTR mRNAを使用する肺におけるCFTR発現の誘導に関連する難点を克服するための十分な助言のいずれも提供しない。これらは、mRNAのインビトロ合成の達成に伴う難点、及びmRNA組成物と肺特異性物質との相互作用に特異的な難点を含み、上記のAndriesらなどの研究者は、対応するDNAベースの組成物がいくらかのレベルの発現を提供したにも関わらず、これらの難点によりmRNA組成物が発現の誘導に無効なものとなっていることを見出している。
したがって、嚢胞性線維症の治療のための、哺乳動物の肺における誘導を含む、CFTR発現の誘導のためのCFTR mRNAの改善された材料、製剤、産生方法、及び送達方法が必要とされている。
国際公開第2007/024708号 米国特許出願公開第2010/0203627号明細書 米国特許出願公開第2011/0035819号明細書
Rowe et al.,New Engl.J.Med.352,1992−2001(2005)
Conese et al.,J.Cyst.Fibros.10 Suppl 2,S114−28(2011)
Rosenecker et al.,Curr.Opin.Mol.Ther.8,439−45(2006)
Alton et al.,Lancet 353,947−54(1999)
Rosenecker et al.,J Gene Med.5,49−60(2003)
Pearson,Nature 460,164−69(2009)
Ernst et al.,J.Gene Med.1,331−40(1999)
Yamamoto,A.et al.Eur.J.Pharm.2009,71,484−489
Debus,H.et al.J.Control Rel.2010,148,334−343
Andries et al.,Mol.Pharmaceut.9,2136−45(2012)

本発明は、部分的には、CFTR mRNA及び非自然発生的CFTR mRNAの製剤の開発、ならびにインビボの機能的CFTR発現を誘導し得るそれらの投与方法に基づく。本発明に従う組成物、方法、及び使用は、嚢胞性線維症の有効な治療に好適な好ましい安全性プロファイルとともに、大型哺乳動物の肺におけるCFTR発現を提供し得る。
したがって、一態様では、本発明は、CFTRタンパク質をコードするmRNAを送達することによって、送達を必要とする対象(例えば、哺乳動物)の、特に肺におけるCFTRのインビボの産生方法を提供する。いくつかの実施形態では、CFTRタンパク質をコードするmRNAは、対象の肺に直接送達される。本明細書において使用される場合、「CFTRタンパク質」は、自然発生的CFTRタンパク質活性の代わりとするため、ならびに/または嚢胞性線維症に関連する1つ以上の症状の強度、重症度、及び/もしくは頻度を低減させるために使用され得る、CFTRタンパク質のいかなる完全長、断片、または部分をも包含する。例えば、本発明に従う好適なCFTRタンパク質は、野生型ヒトCFTRタンパク質(配列番号1)と同一のアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従う好適なCFTRタンパク質は、野生型ヒトCFTRタンパク質(配列番号1)と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列を有し得る。
一実施形態では、本発明は、哺乳動物の肺における上皮細胞中のCFTR発現の誘導方法を提供し、本方法は、哺乳動物の肺における上皮細胞を組成物と接触させることを含み、本組成物は、インビトロ転写mRNAを含む薬学的組成物であり、インビトロ転写mRNAは、配列番号1をコードするコード配列を含む。別の実施形態では、インビトロ転写mRNAは、配列番号1と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列をコードするコード配列を含む。
一実施形態では、本発明は、哺乳動物の標的細胞中のCFTR発現の誘導方法を提供し、本方法は、哺乳動物の標的細胞を組成物と接触させることを含み、本組成物は、配列番号1のアミノ酸配列をコードするインビトロ転写mRNAを含む。別の実施形態では、インビトロ転写mRNAは、配列番号1と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列をコードするコード配列を含む。
別の実施形態では、本発明は、コード配列、5’−UTR、及び3’−UTRを含む非自然発生的mRNA分子を提供し、該コード配列は、配列番号1のアミノ酸配列をコードし、該コード配列は、配列番号3と少なくとも80%同一である。別の実施形態では、該コード配列は、配列番号1と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一のアミノ酸配列をコードする、かつ/または該コード配列は、配列番号3と約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である。
別の実施形態では、本発明は、コード配列、5’−UTR、及び3’−UTRを含む非自然発生的mRNA分子を提供し、該コード配列は、配列番号1のアミノ酸配列をコードし、該コード配列は、配列番号2の野生型コード配列と比べて、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の表1に列記される非野生型塩基を、表1に列記されるコード配列の位置において含む。
別の実施形態では、本発明は、コード配列、5’−UTR、及び3’−UTRを含む非自然発生的mRNA分子を提供し、該コード配列は、配列番号1のアミノ酸配列をコードし、該コード配列は、配列番号2の野生型コード配列と比べて、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の表2に列記される非野生型塩基を、表2に列記されるコード配列の対応する位置において含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、シグナルペプチドのためのコード配列を含む非自然発生的mRNA分子を提供する。特定の実施形態では、本発明は、成長ホルモンリーダー配列のためのコード配列を含む非自然発生的mRNAを提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号18または配列番号19のコード配列を含む、非自然発生的mRNAを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号18または配列番号19に対して少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%のコード配列を含む、非自然発生的mRNAを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、または配列番号17の配列を含む、非自然発生的mRNA分子を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、または配列番号17のいずれかに対して少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%である配列を含む、非自然発生的mRNA分子を提供する。
別の実施形態では、本発明は、本発明に従うmRNAの配列に相補的な配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態では、本発明は、本発明に従うポリヌクレオチド、RNAポリメラーゼ、及びヌクレオシド三リン酸塩を含む、組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、本発明に従うmRNAを含む、薬学的組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、本発明に従う薬学的組成物が装填された、噴霧またはエアロゾル化装置を提供する。
別の実施形態では、本発明は、本発明に従うmRNAと、本mRNAから発現される機能的CFTRと、を含む、培養細胞を提供する。
別の実施形態では、本発明は、機能的CFTRの発現の誘導のための、本発明に従う薬学的組成物の使用を提供する。
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物の肺における上皮細胞中のCFTR発現の誘導方法を提供し、本方法は、上皮細胞を組成物と接触させることを含み、本組成物は、本発明に従うmRNAを含む薬学的組成物である。
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物の標的細胞中のCFTR発現の誘導方法を提供し、本方法は、哺乳動物の標的細胞を組成物と接触させることを含み、本組成物は、本発明に従うmRNAを含む。
別の実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象に、本明細書に記載のCFTRタンパク質をコードするmRNAを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。一実施形態では、本mRNAは、対象の肺に投与される。一実施形態では、本mRNAは、吸入、噴霧、鼻腔内投与、またはエアロゾル化によって投与される。様々な実施形態では、本mRNAの投与は、対象の肺におけるCFTRの発現をもたらす。
特定の実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象の肺に、配列番号1をコードするコード配列を含むmRNAを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象の肺に、野生型ヒトCFTRタンパク質(配列番号1)と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列をコードするコード配列を含むmRNAを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。別の特定の実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象の肺に、配列番号3のコード配列を含むmRNAを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象の肺に、配列番号3と少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一のコード配列を含むmRNAを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載される、CFTRタンパク質をコードするmRNAの作製方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ヌクレオシド三リン酸塩の存在下で、単離ポリヌクレオチドをRNAポリメラーゼと接触させることを含む、インビトロのCFTR mRNAの作製方法を提供し、該単離ポリヌクレオチド及びRNAポリメラーゼは、細胞中に含有されず、該単離ポリヌクレオチドは、該RNAポリメラーゼのための鋳型であり、該単離ポリヌクレオチドは、鋳型配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、該鋳型配列は、配列番号1をコードする配列に相補的であるコード配列補体を含み、(a)該鋳型配列は、配列番号2の補体よりも少ないクリプティックプロモーター(cryptic promoter)を含むか、(b)該鋳型配列は、配列番号2よりも少ない直列反復及び/もしくは逆方向反復を含むか、(c)該鋳型配列は、配列番号2よりも少ない不利なコドン(disfavored codon)の補体を含むか、または(d)該コード配列補体のGC含量は、配列番号2のGC含量よりも低い。
別の実施形態では、本発明は、ヌクレオシド三リン酸塩の存在下で、本発明に従う単離ポリヌクレオチドをRNAポリメラーゼと接触させることを含む、インビトロのCFTR mRNAの作製方法を提供し、該単離ポリヌクレオチド及びRNAポリメラーゼは、細胞中に含有されず、該単離ポリヌクレオチドは、該RNAポリメラーゼのための鋳型であり、該単離ポリヌクレオチドは、鋳型配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、該RNAポリメラーゼは、配列番号1をコードするコード配列を含むmRNAを合成する。
かかる使用及び治療方法のいくつかの実施形態では、インビトロ転写mRNAは、非自然発生的UTRを含むように修飾されたヒトCFTR(配列番号2)をコードする自然発生的または野生型mRNAである。他の実施形態では、インビトロ転写mRNAは、上述の非自然発生的mRNAである。
本発明の追加の目的及び利点は、部分的には、以下の説明において述べられ、部分的には、その説明から明らかになるか、または本発明の実践によって学習され得る。本発明の目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において具体的に指摘される要素ならびに組み合わせによって実現及び達成されるであろう。
前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方は例示かつ説明に過ぎず、特許請求される、本発明を制限するものではないことを理解されたい。
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を例示し、説明とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。
本発明の前述の態様及び利点は、添付の図面を参照して以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
ヒトCFTR mRNAのトランスフェクションの24時間後のヒトCFTRタンパク質の成熟型「C」バンドの検出。成功裏のタンパク質産生が、無修飾及び修飾(SNIM)mRNAの両方(25%の2−チオウリジン及び5−メチルシチジンを含む)について観察された。免疫沈降は、R&D SystemsのMAB25031抗体及びAb570を使用する検出を使用して実施された。 PEI/無修飾ヒトCFTR mRNAナノ粒子の曝露の24時間後のCFTR KOマウス肺のウェスタンブロット分析。マウスは、およそ1時間にわたって、噴霧(Pari Boyジェット噴霧器)を介して処置された。提供された方法に従って抽出されたヒトCFTRタンパク質の免疫沈降が実施された。成熟型「C」バンドは、対照マウスでは観察されないが、すべての処置マウスにおいて検出される。 処置済(4ugのhCFTR mRNA)及び無処置HEK293T細胞の8−Br−cAMP誘起電流の電流−電圧プロット。無処置細胞と比較して、hCFTR mRNAのトランスフェクト細胞中で大電流が誘導される。特異的CFTRタンパク質阻害剤、CFTRinh−172に曝露された処置細胞は、Cl−イオン電流の流れにおける顕著な低減(約89%)を示す。 +80mVの膜電位の適用時の処置済(4ugのhCFTR mRNA)及び無処置HEK293T細胞の8−Br−cAMP誘起電流のヒストグラムプロット。無処置細胞と比較して、hCFTR mRNAのトランスフェクト細胞中で大電流が誘導される。特異的CFTRタンパク質阻害剤、CFTRinh−172に曝露された処置細胞は、Cl−イオン電流の流れにおける顕著な低減(約89%)を示す。 未変性、ホルスコリン、及びGlyH−101曝露のHEK 293細胞のプロファイルを比較する電流−電圧プロット。電流の有意な変化は、いずれの状況でも観察されなかった。 処置済(4ugのhCFTR mRNA)及び無処置HEK293細胞のホルスコリン誘起電流の電流−電圧プロット。無処置細胞と比較して、hCFTR mRNAのトランスフェクト細胞中で大電流が誘導される。特異的CFTRタンパク質阻害剤、GlyH−101に曝露された処置細胞は、グラフ右側のステッププロット(+100mV)で実証される通り、Cl−イオン電流の流れにおける顕著な低減(約95%)を示す。 無処置(PBS)(左)及び処置済(右)のCFTR KOマウス肺におけるヒトCFTR mRNAのインサイツのハイブリダイゼーション。マウスは、気管内投与を介して、PEIナノ粒子中の30ugの被包された無修飾hCFTR mRNAに曝露された。実質的な陽性染色が、投与の24時間後における両方の肺全体で観察される。 異なる拡大率の図(最大20倍の拡大率)での、ヒトCFTR mRNAで処置されたCFTR KOマウス肺のインサイツのハイブリダイゼーション。マウスは、気管内投与を介して、PEIナノ粒子中の30ugの被包された無修飾hCFTR mRNAに曝露された。 ヒトCFTR mRNAで処置された(右)CFTR KOマウス肺のインサイツのハイブリダイゼーションを示す高拡大率(40倍)の代表的な肺切片。ヒトCFTR mRNAが、投与の24時間後の標的の気管支上皮細胞の頂端細胞質中で検出された。マウスは、気管内投与を介して、PEIナノ粒子中の30ugの被包された無修飾hCFTR mRNAに曝露された。 投与の6時間後(左)及び24時間後(右)におけるヒトCFTR mRNAで処置されたCFTR KOマウス肺のインサイツのハイブリダイゼーション染色の比較。マウスは、気管内投与を介して、PEIナノ粒子中の30ugの被包された無修飾hCFTR mRNAに曝露された。強い陽性細胞内染色が、6時間以内に両方の肺全体で気管支及び肺胞の領域内に観察され、一方で、実質的な陽性染色は、投与の24時間後において依然として観察される。 無処置(PBS)(上部)及び処置済(下部)のCFTR KOマウス肺におけるヒトCFTR mRNAのインサイツのハイブリダイゼーション。マウスは、気管内投与を介して、C12−200脂質ナノ粒子中の15ugの被包された無修飾hCFTR mRNAに曝露された。実質的な陽性染色が、投与の6時間後における両方の肺全体で観察される。 ヒトCFTR mRNAで処置されたCFTR KOマウス肺のインサイツのハイブリダイゼーションを示す高拡大率(40倍)の代表的な肺切片。ヒトCFTR mRNAが、投与の6時間後において標的の気管支上皮領域(左)ならびに細胞内肺胞領域(右)の頂端細胞質中で検出された。マウスは、気管内投与を介して、C12−200脂質ナノ粒子中の15ugの被包された無修飾hCFTR mRNAに曝露された。 hCFTR発現のための異なる細胞株のスクリーニング。hCFTRをコードするコンストラクトをトランスフェクトされたCHO及びCOS−7(A)ならびにBHK及びPKC(B)細胞の免疫ブロット。タンパク質ライセートをトランスフェクションの24時間後に調製し、一次抗体としてMA1−935を使用してスクリーニングした。矢印は推定のCFTRを示す。実施例6にてMA1−935特異性の記述を参照されたい。 異なる抗ヒトCFTR抗体の交差反応性。(A)‐マウス抗ヒトCFTR MA1−935(Chemicon)、(B)‐マウス抗ヒトCFTR AB570(Cystic Fibrosis Foundation)、(C)‐マウス抗ヒトCFTR AB596(Cystic Fibrosis Foundation)、(D)ウサギ抗ヒトCFTR G449(Rockefeller University)。矢印はCFTRを示す。 3つの異なる抗体(R29、R66/17、及びR66/16)を使用するヒトCFTRの免疫沈降、続いてAB596を使用する免疫検出。レーン1:T84細胞(陽性対照)、レーン2:無処置のブタ肺組織(300mg)、レーン3:処置されたブタ肺組織(697mg)、レーン4:処置されたブタ肺組織(163mg)。 それぞれ実施例6のHGT5001製剤中の20μgのhCFTR SNIM RNA/10μgのFFL SNIM RNAの髄腔内スプレー適用の24時間後におけるマウスの免疫沈降及びウェスタンブロッティング。T84細胞は、hCFTRの成熟型グリコシル化Cバンド及びマンノシル化Bバンドを示す陽性対照とした。「上清」は、免疫沈降した画分を有しない残りの細胞抽出画分。「IP」は、免疫沈降した画分。 MAB25031を使用するT84細胞からのhCFTRの免疫沈降、続いてAB570(A)及びMAB1660(B)を使用する免疫検出。 MAB25031を使用するT84細胞からのhCFTRの免疫沈降、続いてAB570(A)及びMAB1660(B)を使用する免疫検出。 異なるコンストラクトのトランスフェクションの72時間後におけるNIH3T3細胞からのCFTRの免疫沈降。 500ugのタンパク質及びMAB1660(左及び中央のパネル)ならびにMAB25031を使用する(右のパネル)増加した量の総タンパク質(8mg)を使用する、異なるコンストラクトのトランスフェクションの72時間後におけるNIH3T3細胞からのCFTRの免疫沈降。 MAB25031を使用するhCFTRの免疫沈降、及び、実施例6のPEI製剤中のhCFTR SNIM RNA送達後のブタ肺試料からのAB570を使用するその後の免疫検出。レーン1:ブタ2番のルシフェラーゼ陰性左尾状葉からの試料、レーン2:ブタ1番のルシフェラーゼ陽性肺領域からの試料。 麻酔及び換気されたブタ(左)に噴霧が実施された。噴霧器は換気系にインラインで接続された(右、白の矢印参照)。 EFlowメッシュ噴霧器を用いた、実施例6のPEI製剤中の1mgのFFL SNIMRNAのエアロゾル投与後、異なる肺領域からのブタ組織検体のホモジネートにおいて測定されたルシフェラーゼ発現。肺検体は、ルシフェラーゼ測定(肺組織1mg当たりのpgルシフェラーゼ)の前に、エクスビボで一晩培養された。 実施例6のPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNAのエアロゾル投与後の、異なる肺領域からの代表的なブタ組織検体におけるルシフェラーゼ発現のBLI。肺検体は、測定前にエクスビボで一晩培養された。 PARI BOYジェット噴霧器を使用する、実施例6のPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNAのエアロゾル投与後の、異なる肺領域からの代表的なブタ組織検体におけるルシフェラーゼ発現のBLI造影。肺検体は、測定前にエクスビボで一晩培養された。 Aeronebメッシュ噴霧器を使用する、実施例6のPEI製剤中の各1mgのFFL SNIM RNA及びhCFTR mRNAのエアロゾル投与後の、異なる肺領域からの代表的なブタ組織検体におけるルシフェラーゼ発現のBLI。肺検体は、測定前にエクスビボで一晩培養された。 Aeronebメッシュ噴霧器を使用する、「SHIRE製剤3番」(HGT5001:DOPE:Chol:DMGPEG2K(50:25:20:5)(モル比)中の1mgのFFL SNIM RNAのエアロゾル投与後の、異なる肺領域からの代表的なブタ組織検体におけるルシフェラーゼ発現のBLI。肺検体は、測定前にエクスビボで一晩培養された。 1頭の無処置対照ブタからの異なる肺領域からのブタ組織検体におけるルシフェラーゼ発現のBLI。他方の無処置対照ブタは、同じ結果を示した(データは示さず)。 1回処置されたブタ3番及び6番の肺検体におけるルシフェラーゼ発現のBLI。実施例6のPEI製剤中の各1mgのFFL SNIM RNA及びhCFTR SNIM RNAのエアロゾル投与が、Aeronebメッシュ噴霧器を使用して実施された。ブタ肺全体のスライスが示されている。上3行:ブタ3番、下3行:ブタ6番。 2回処置されたブタ4番及び8番の肺検体におけるルシフェラーゼ発現のBLI。実施例6のPEI製剤中の各1mgのFFL SNIM RNA及びhCFTR SNIM RNAのエアロゾル投与が、Aeronebメッシュ噴霧器を使用して実施された。ブタ肺全体のスライスが示されている。上3行:ブタ4番、下3行:ブタ8番。 3回処置されたブタ1番及び2番の肺検体におけるルシフェラーゼ発現のBLI。実施例6のPEI製剤中の各1mgのFFL SNIM RNA及びhCFTR−mRNA SNIM RNAのエアロゾル投与が、Aeronebメッシュ噴霧器を使用して実施された。ブタ肺全体のスライスが示されている。上3行:ブタ1番、下3行:ブタ2番。 3回処置されたブタ1番の肺組織に対するルシフェラーゼIHC。実施例6のPEI製剤中の各1mgのFFL SNIM RNA及びhCFTR SNIM RNAのエアロゾル投与が、Aeronebメッシュ噴霧器を使用して実施された。ルシフェラーゼ発現は、赤みがかったピンク色に見えた(抗ルシフェラーゼpAb 1:300、G7451、Promega、Refine AP−Kit、色素原:ニューフクシン)。 3重処置されたブタ1番の高度にBLI陽性の肺組織は、hCFTRのIP/WBを受けた。レーン1:T84細胞(陽性対照)、レーン2:無処置のブタ肺組織(300mg)、レーン3:処置されたブタ肺組織(697mg)、レーン4:処置されたブタ肺組織(163mg)。成熟型複合グリコシル化hCFTRが、分散したいわゆるCバンドとして現れた。マンノースが豊富なhCFTRが、より高密度ないわゆるBバンドとして現れた。hCFTR発現が、T84細胞、及びhCFTR SNIM RNAで処置されたブタ1番のブタ肺組織中で観察され、一方で、無処置のブタにおいてhCFTR発現は観察されなかった。 MAB25031を使用するhCFTRの免疫沈降、及び、実施例6のPEI製剤中のhCFTR SNIM RNA送達後のブタ肺試料からのAB570を使用するその後の免疫検出。レーン1:ブタ2番のルシフェラーゼ陰性左尾状葉からの試料、レーン2:ブタ1番のルシフェラーゼ陽性肺領域からの試料。 HEK 293T細胞への、C末端His10タグ付き(CO−CFTR−C−His10)及びタグなし(CO−CFTR)のコドン最適化ヒトCFTR SNIM RNAの、インビトロのトランスフェクション。トランスフェクション後、細胞全体のライセートが採取され、(A)抗CFTR抗体217番及び(B)抗His抗体1187を使用するウェスタンブロットによって、ヒトCFTR発現について分析された。トランスフェクトされた試料は、非トランスフェクションHEK 293T対照ライセート(レーン3)と比較された。 HEK 293T細胞への、成長ホルモンリーダー配列及び(GH−CO−CFTR)を有するコドン最適化ヒトCFTRをコードするSNIM RNA、または、C末端His10タグ付きコドン最適化ヒトCFTR(CO−CFTR−C−His10)をコードするSNIM RNAの、インビトロのトランスフェクション。トランスフェクション後、細胞全体のライセートが採取され、抗CFTR抗体217番を使用するウェスタンブロットによって、ヒトCFTR発現について分析された。トランスフェクトされた試料は、非トランスフェクションHEK 293T対照ライセート(レーン3)と比較された。 CFTRノックアウトマウスへの、脂質(cKK−E12)またはポリマー(PEI)ナノ粒子製剤のいずれかの中に被包されたC末端His10タグ付きコドン最適化ヒトCFTR SNIM RNAの、インビボのトランスフェクション。各mRNA製剤それぞれの噴霧送達後、右及び左の肺組織のライセートが採取され、抗His抗体1187を使用するウェスタンブロットによって、CFTR発現について分析された。対照CFTRノックアウト肺組織及びCFTR−His10 HEK293のライセートが、それぞれ陰性対照及び陽性対照として使用された。 注射用水の噴霧後に採取されたブタの肺試料におけるFFL発現の生物発光検出。 分岐状の25kDaのPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA+1mgのCO−CFTR SNIM RNAの噴霧後に採取されたブタの肺試料におけるFFL発現の生物発光検出。 分岐状の25kDaのPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA+5mgのCO−CFTR SNIM RNAの噴霧後に採取されたブタの肺試料におけるFFL発現の生物発光検出。 分岐状の25kDaのPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA+10mgのCO−CFTR SNIM RNAの噴霧後に採取されたブタの肺試料におけるFFL発現の生物発光検出。 異なるコホートにおけるCFTR発現の相対定量。バンド強度は、タンパク質ラダー内の150kDaのバンドに正規化された。 上皮細胞層内で少なくとも1つの上皮細胞が検出され、抗CFTR抗体を使用するCFTR免疫組織化学的染色を介して明らかな膜局在型CFTRシグナルを示す、「CFTR陽性」の気管支の代表的な例。 対照(WFI)または5mgのCO−CFTR SNIM RNAのエアロゾル送達後のブタの肺におけるCFTRの免疫組織化学的染色。 5mgのCO−CFTR SNIM RNAのエアロゾル送達後の抗CFTRを用いた免疫組織化学的染色によってブタの肺においてアッセイされた「低い」CFTR発現レベルを表す。 5mgのCO−CFTR SNIM RNAのエアロゾル送達後の抗CFTRを用いた免疫組織化学的染色によってブタの肺においてアッセイされた「中間の」CFTR発現レベルを表す。 5mgのCO−CFTR SNIM RNAのエアロゾル送達後の抗CFTRを用いた免疫組織化学的染色によってブタの肺においてアッセイされた「高い」CFTR発現レベルを表す。 対照(WFI)または10mgのCO−CFTR SNIM RNAのエアロゾル送達後のブタの肺におけるCFTRの免疫組織化学的染色。 動物当たりのCFTR陽性の気管支/細気管支の相対数の定量。エアロゾル投与の24時間後の各コホート(WFI、及び1mg、5mg、10mgのヒトCFTR SNIM RNA)の分析。150kDaのタンパク質標準のシグナル強度に正規化されたCFTR発現。(WFI=9.4±5.6%、1MG=15.2±6.6%、5MG=25.4±14.1%、10MG=20.9±3.7%、WFI対5MG p=0.0281、WFI対10MG p=0.0174) 噴霧器による注射用水のエアロゾル送達後の、ブタの肺における(A)ユビキチンC及び(B)dap Bの、多重核酸のインサイツの検出を示す。 噴霧器による注射用水のエアロゾル送達後の、ブタの肺における(A)ユビキチンC及び(B)dap Bの、多重核酸のインサイツの検出を示す。 分岐状の25kDaのPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA+10mgのCO−CFTR SNIM RNAのエアロゾル送達後の、ブタの肺における(A)ユビキチンC及び(B)dap Bの多重核酸のインサイツの検出を示す。 分岐状の25kDaのPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA+10mgのCO−CFTR SNIM RNAのエアロゾル送達後の、ブタの肺における(A)ユビキチンC及び(B)dap Bの多重核酸のインサイツの検出を示す。 噴霧器による注射用水のエアロゾル送達後の、ブタにおける(A)右頭蓋及び(B)左頭蓋の多重核酸のインサイツの検出を示す。 噴霧器による注射用水のエアロゾル送達後の、ブタにおける(A)右頭蓋及び(B)左頭蓋の多重核酸のインサイツの検出を示す。 分岐状の25kDaのPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA+1mgのCO−CFTR SNIM RNAのエアロゾル送達後の、ブタにおける(A)右頭蓋及び(B)左頭蓋の多重核酸のインサイツの検出を示す。 分岐状の25kDaのPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA+1mgのCO−CFTR SNIM RNAのエアロゾル送達後の、ブタにおける(A)右頭蓋及び(B)左頭蓋の多重核酸のインサイツの検出を示す。 分岐状の25kDaのPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA+5mgのCO−CFTR SNIM RNAのエアロゾル送達後の、ブタにおける(A)右頭蓋及び(B)左頭蓋の多重核酸のインサイツの検出を示す。 分岐状の25kDaのPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA+5mgのCO−CFTR SNIM RNAのエアロゾル送達後の、ブタにおける(A)右頭蓋及び(B)左頭蓋の多重核酸のインサイツの検出を示す。 分岐状の25kDaのPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA+10mgのCO−CFTR SNIM RNAのエアロゾル送達後の、ブタにおける(A)右頭蓋及び(B)左頭蓋の多重核酸のインサイツの検出を示す。 分岐状の25kDaのPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA+10mgのCO−CFTR SNIM RNAのエアロゾル送達後の、ブタにおける(A)右頭蓋及び(B)左頭蓋の多重核酸のインサイツの検出を示す。 FFL/CO−CFTR−C−His10 mRNAを被包したcKK−E12脂質ナノ粒子への曝露時の、処置されたブタ肺の活性ホタルルシフェラーゼ(FFL)タンパク質の発光を介する陽性検出を示す。ブタは、Pariジェット噴霧器を使用する噴霧を介して、1mgのFFL+9mgのCO−CFTR−C−His10 mRNAを被包した脂質ナノ粒子で処置され、処置の24時間後に屠殺された。FFL発光は、IVIS生物発光計を使用して可視化された。 FFL/CO−CFTR−C−His10 mRNAを被包したcKK−E12脂質ナノ粒子への曝露時の、処置されたブタ肺の活性ホタルルシフェラーゼ(FFL)タンパク質の発光を介する陽性検出を示す。ブタは、Pariジェット噴霧器を使用する噴霧を介して、1mgのFFL+9mgのCO−CFTR−C−His10 mRNAを被包した脂質ナノ粒子で処置され、処置の24時間後に屠殺された。FFL発光は、IVIS生物発光計を使用して可視化された。 ブタ10、11、及び12(1mg用量)に与えられた噴霧される複合体を使用してトランスフェクトされたHEK細胞中のhCFTR発現の例示的な結果を示す。 ブタ13、14、及び15(5mg用量)に与えられた噴霧される複合体を使用してトランスフェクトされたHEK細胞、ならびにブタ19、20、及び21(10mg用量)に与えられた噴霧される複合体を使用してトランスフェクトされたHEK細胞中のhCFTR発現の例示的な結果を示す。 ブタ16(5mg用量)、22(10mg用量)、及び67(1mg用量)に与えられた噴霧される複合体を使用してトランスフェクトされたHEK細胞中のhCFTR発現の例示的な結果を示す。 ブタ17、18(5mg用量)、23、24(10mg用量)、及び68、69(1mg用量)に与えられた噴霧される複合体を使用してトランスフェクトされたHEK細胞中のhCFTR発現の例示的な結果を示す。
定義
本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、一般的に、核酸(例えば、DNAまたはRNA)を指すために使用される。ポリヌクレオチド、核酸、DNA、RNA、及びmRNAという用語は、標準的または無修飾の残基、非標準的または修飾された残基、ならびに標準的残基及び非標準的残基の混合物からなる分子を含む。
本明細書において使用される場合、用語「mRNA」は、コード領域及び非コード領域の両方を含む修飾RNA及び無修飾RNAを指すために使用される。
本明細書において使用される場合、mRNAの「コード領域」という語句は、一般的に、翻訳されると、ポリペプチド、タンパク質、または酵素などの発現産物の産生をもたらす部分を指す。
「非標準核酸塩基」は、天然の塩基アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)、またはウラシル(U)以外の塩基部分である。非標準核酸塩基は、Tの類似体が一般的にUの類似体でもある(逆もまた同じ)ことを除いて、核酸の二重らせんにおけるその塩基対形成特性、及び、核酸の二重らせん(RNAポリメラーゼによるDNA鋳型の転写の間に形成されるものなどの局在性RNA−DNAらせんを含む)におけるDNAまたはRNAポリメラーゼによる組み込みの座位が、以前に列記した5つの核酸塩基のうちの1つに最も類似している場合、特異的な核酸塩基(A、C、G、T、またはU)の類似体である。第2の配列に対する第1の配列の同一性の割合を決定する目的のため、塩基の類似体は、天然の塩基に対してミスマッチではない(例えば、プソイドウリジンはウリジンにマッチし、5−メチルシチジンはシチジンにマッチするなど)。
「ヌクレオシド」、「塩基」、「ヌクレオチド」または「残基」を含むがこれらに限定されない用語と併せて使用される用語「非標準的」は、「核酸塩基」と併せて使用されているかのような場合と同様に解釈されるものとする。
「GC含量」は、グアニン残基、シトシン残基、またはこれらの類似体である、核酸配列における合計の核酸塩基残基の分率または割合である。例えば、正確に30のシトシン、正確に30のグアニン、正確に1つのシトシン類似体、及び正確に1つのグアニン類似体を含有する100ntの配列は、62%のGC豊富度を有する。
本明細書において使用される場合、「不利なコドン」は、哺乳動物細胞によって、同じアミノ酸残基の別のコドンほど効率的または急速に翻訳されないコドンを指す。不利なコドンは、一般的に、コドンの第3あるいは「ゆらぎ(wobble)」位置にAまたはUを有するコドンを含む。不利なコドンの記述については、例えば、米国特許公開第2009/0069256 A1号を参照されたい。
「非自然発生的mRNA分子」は、野生型細胞の通常の転写及びスプライシング過程を介して産生されないmRNAである。mRNAは、その配列の長所(例えば、いずれの自然発生的CFTR mRNAにおいても現れない一連のコドン及び/または1つ以上のUTR)によって、かつ/または、それが非標準的ヌクレオチド残基を含むため、非自然発生的と見なされ得る。非自然発生的mRNA分子は、インビトロ合成され得る。
以下の表1及び2それぞれにおいて、非野生型の列は、CFTRコード配列中の位置((Pos.)における非野生型塩基を示し(例えば、配列番号3を参照されたい)、野生型の列は、同じ位置における野生型塩基を示す(例えば、配列番号2またはヒトCFTRのRefSeqエントリー(GenBankから入手可能な受入番号NM_000492.3、2013年2月10日バージョン)を参照されたい。NM_000492.3の配列は、例えば、以下の表中の位置7がNM_000492.3配列の位置139に対応するように、そのコード配列が位置133〜4575において生じるように非コード配列を含有することに留意されたい)。
非自然発生的CFTR mRNA
自然発生的または野生型のCFTR mRNA(及びそのmRNAを含む組成物)を使用するインビボの機能的CFTRの産生方法を提供することに加えて、本発明は、CFTRタンパク質(例えば、配列番号1)をコードする非自然発生的CFTR mRNAも提供する。いくつかの実施形態では、非自然発生的CFTR mRNAは、精製または単離される。
他の実施形態では、非自然発生的CFTR mRNAは、細胞中に存在する。いくつかの実施形態では、非自然発生的CFTR mRNAを含む細胞は、非自然発生的CFTR mRNAを合成しなかった、かつ/または、非自然発生的CFTR mRNA及び/もしくは機能的CFTR遺伝子に相補的なDNAを含まず、この細胞は、不活性CFTR遺伝子、例えば、遺伝子の発現産物を非機能性にする、ナンセンス変異、ミスセンス変異、フレームシフト変異、挿入変異、または欠失変異を有するCFTR遺伝子などを任意に含み得る。いくつかの実施形態では、非自然発生的CFTR mRNAを含む細胞は、非自然発生的CFTR mRNAから翻訳された機能的CFTRタンパク質をさらに含む。該細胞は、例えば、肺上皮細胞、肝細胞、または腎細胞であり得る。いくつかの実施形態では、該細胞は細胞培養物中にある。
CFTRコード配列
いくつかの実施形態では、本発明に従うCFTR mRNAは、配列番号2(すなわち、野生型ヒトCFTRのコード配列)よりも少ないクリプティックプロモーターの補体、配列番号2よりも少ない直列反復及び/もしくは逆方向反復、配列番号2よりも少ない不利なコドンを有するコード配列を含む、かつ/または、該コード配列のGC含量が、配列番号2のGC含量よりも低い。
配列のクリプティックプロモーター、直列反復及び/もしくは逆方向反復、ならびに/または不利なコドンは、日常的な方法を使用して当業者によって認識され得る。例えば、配列の直列反復及び/もしくは逆方向反復含量は、配列分析によって決定され得る(Liu et al.,Journal of Theoretical Biology(2014)344:19−30)。配列のクリプティックプロモーター含量も、配列分析、例えば、コンストラクトなどの中のShine−Dalgarno配列の存在によって決定され得る。
いくつかの実施形態では、本発明に従うCFTR mRNAはインビトロ転写され、すなわち、本mRNAは、生物学的細胞中ではない人工的な設定(例えば、細胞を有しないインビトロ転写系)で合成された。一般的に、インビトロ転写は、好適な反応条件(塩、緩衝液、及び温度)で、プロモーター及び所望のmRNA(これは環状または線状であり得る)に相補的な配列を含むDNA鋳型、RNAポリメラーゼ、ならびにヌクレオシド三リン酸塩を提供することを含む。リボヌクレアーゼ阻害剤、還元剤、及び/またはピロホスファターゼが、反応混合物中に存在し得る。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼはT7 RNAポリメラーゼである。
いくつかの実施形態では、本発明に従うCFTR mRNAは、配列番号2の野生型コード配列と比べて、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の表1に列記される非野生型塩基を、表1に列記されるコード配列の位置において含む、コード配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明に従うCFTR mRNAは、配列番号2の野生型コード配列と比べて、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の表2に列記される非野生型塩基を、表2に列記されるコード配列の対応する位置において含む、コード配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号3のコード配列を含む、非自然発生的CFTR mRNAを含む。追加の例示的な非自然発生的CFTR mRNAコード配列、例えば、配列番号9、10、11、12、13、14、15、16、または17などは、配列の簡単な説明の項に記載される。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号3、9、10、11、12、13、14、15、16、または17のうちのいずれかと、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一のコード配列を含む、CFTR mRNAを提供する。いくつかの実施形態では、非自然発生的CFTR mRNAは、以下に記載の、5’UTR、3’UTR、シグナルペプチドコード配列、またはキャップもしくはテール構造を含む。
野生型CFTRコード配列と異なるコード配列を含む上述のCFTR mRNAは、有効性及び調製の容易さに関する利点を提供し得る。例えば、CFTRコード配列に相補的な鋳型配列を含むポリヌクレオチドを使用するインビトロ転写反応は、より高いRNA収率をもたらし得、該鋳型配列を含むポリヌクレオチドは、宿主細胞内での成長の間により安定しており(すなわち、より変異しにくくなり)、反応において使用可能な鋳型を生成するために必要な精製の量を低減し得、該コード配列を含むmRNAのインビボ翻訳は、より高くなり得る。
シグナルペプチド配列
いくつかの実施形態では、CFTRタンパク質をコードするmRNAは、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を組み込む。本明細書において使用される場合、用語「シグナルペプチド」は、タンパク質の標的を分泌経路に定め得る、新たに合成されたタンパク質において存在するペプチドを指す。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、mRNAの翻訳に続く小胞体内への移行後に切断される。シグナルペプチドは、シグナル配列、リーダー配列、またはリーダーペプチドとも称される。典型的に、シグナルペプチドは短い(例えば、5〜30、5〜25、5〜20、5〜15、または5〜10アミノ酸長の)ペプチドである。シグナルペプチドは、新たに合成されたタンパク質のN末端に存在し得る。いかなる特定の理論にも制限されることを望むものではないが、CFTRをコードするmRNAへのシグナルペプチドをコードする配列の組み込みは、インビボのCFTRタンパク質の分泌及び/または産生を促進し得る。
本発明に好適なシグナルペプチドは、様々な真核生物タンパク質及び原核生物タンパク質に由来する、特に分泌タンパク質における、異種性の配列であり得る。いくつかの実施形態では、好適なシグナルペプチドは、ロイシンが豊富な配列である。参照により本明細書に組み込まれる、Yamamoto Y et al.(1989),Biochemistry,28:2728−2732を参照されたい。好適なシグナルペプチドは、ヒト成長ホルモン(hGH)、血清アルブミンプレプロタンパク質、Igカッパ軽鎖前駆体、アズロシジンプレプロタンパク質、シスタチン−S前駆体、トリプシノーゲン2前駆体、カリウムチャネルブロッカー、αコノトキシンlp1.3、αコノトキシン、αガラクトシダーゼ、セルロース、アスパラギン酸プロテイナーゼネペンテシン−1、酸キチナーゼ、K28プレプロ−トキシン、キラートキシンジゴシン(zygocin)前駆体、及びコレラトキシンに由来し得る。例示的なシグナルペプチド配列は、参照により本明細書に組み込まれる、Kober,et al.,Biotechnol.Bioeng.,110:1164−73,2012に記載されている。
いくつかの実施形態では、CFTRをコードするmRNAは、ヒト成長ホルモン(hGH)に由来するシグナルペプチドをコードする配列、またはその断片を組み込み得る。hGHシグナルペプチドをコードする非限定的なヌクレオチド配列は、以下に示される。
5’ヒト成長ホルモン(hGH)配列(配列番号18):
AUGGCCACUGGAUCAAGAACCUCACUGCUGCUCGCUUUUGGACUGCUUUGCCUGCCCUGGUUGCAAGAAGGAUCGGCUUUCCCGACCAUCCCACUCUCC
代替的な5’ヒト成長ホルモン(hGH)配列(配列番号19):
AUGGCAACUGGAUCAAGAACCUCCCUCCUGCUCGCAUUCGGCCUGCUCUGUCUCCCAUGGCUCCAAGAAGGAAGCGCGUUCCCCACUAUCCCCCUCUCG
いくつかの実施形態では、本発明に従うmRNAは、配列番号18または配列番号19と、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い同一性を有するシグナルペプチドをコードする配列を組み込み得る。
5’−UTR、3’−UTR、ポリAテール、キャップ、及び非標準的ヌクレオチド残基
いくつかの実施形態では、本mRNAは、その5’−UTRにおいて、配列番号4と同一であるか、または配列番号4と少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含む。
いくつかの実施形態では、本mRNAは、その3’−UTRにおいて、配列番号5と同一であるか、または配列番号5と少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含む。
いくつかの実施形態では、本mRNAはポリAテールを含む。いくつかの実施形態では、ポリAテールは、少なくとも70、100、120、150、200、250、300、400、または500の残基長を有する。いくつかの実施形態では、ポリAテールは、70〜100、100〜120、120〜150、150〜200、または200〜300、300〜400、または400〜500の範囲の残基長を有する。ポリAテールは、当該技術分野において承認されている様々な技術を使用して付加され得る。例えば、長いポリAテールは、ポリAポリメラーゼを使用して合成またはインビトロ転写RNAに付加され得る(Yokoe,el al.Nature Biotechnology.1996;14:1252−1256)。転写ベクターも、長いポリAテールをコードすることができる。さらに、ポリAテールは、PCR産物からの直接的な転写によって付加され得る。ポリAはまた、RNAリガーゼを用いてセンスRNAの3’末端に連結され得る(例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.,ed. by Sambrook,Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1991 edition)を参照されたい)。いくつかの実施形態では、ポリAテールの代わりに、またはそれに加えて、ポリUもしくはポリCテールが使用され得る。例えば、CFTRをコードするmRNAは、3’ポリ(C)テール構造を含み得る。mRNAの3’末端上の好適なポリCテールは、約10〜200のシトシンヌクレオチド(例えば、約10〜150のシトシンヌクレオチド、約10〜100のシトシンヌクレオチド、約20〜70のシトシンヌクレオチド、約20〜60のシトシンヌクレオチド、または約10〜40のシトシンヌクレオチド)を典型的に含む。ポリCテールは、ポリAテールに付加されるか、またはポリAテールを置換し得る。
いくつかの実施形態では、本mRNAは、5’キャップ、例えば、キャップ1構造を含む。mRNAキャッピング酵素及び手順については、例えば、Fechter,P.;Brownlee,G.G.“Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins”J.Gen.Virology 2005,86,1239−1249、欧州特許公開2 010 659 A2、米国特許第6,312,926号を参照されたい。5’キャップは、典型的に、以下の通りに付加される;まず、RNA末端ホスファターゼが、末端リン酸基のうちの1つを5’ヌクレオチドから除去して、2つの末端リン酸を残し、次にグアノシン三リン酸塩(GTP)が、グアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加され、5’5’5三リン酸塩連鎖を産生し、次にグアニンの7−窒素が、メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。キャップ構造の例としては、m7G(5’)ppp(5’(A,G(5’)ppp(5’)A及びG(5’)ppp(5’)Gが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本mRNAは、1つ以上の非標準的ヌクレオチド残基を含む。非標準的ヌクレオチド残基は、例えば、5−メチル−シチジン(「5mC」)、プソイドウリジン(「ψU」)、及び/または2−チオ−ウリジン(「2sU」)を含み得る。かかる残基及びmRNAへのそれらの組み込みの記述については、例えば、米国特許第8,278,036号または国際公開第WO2011012316号を参照されたい。いくつかの実施形態では、mRNAはSNIM RNAであり得る。本明細書において使用される場合、SNIM RNAは、PCT公開第WO2011/012316号に記載の、IVT反応においてある特定の割合の修飾ヌクレオチドを含む、インビトロ転写(IVT)によって産生される伝令RNAを示す、安定化非免疫原性伝令RNAの頭字語である。本明細書に開示される実施例において使用されるSNIM RNAは、U残基の25%が2−チオ−ウリジンであり、C残基の25%が5−メチルシチジンであったIVTによって産生された。非標準的ヌクレオチド残基の存在は、mRNAを、同じ配列を有するが標準的残基しか含有しない対照mRNAよりも安定的にする、かつ/またはそれよりも免疫原性でなくし得る。さらなる実施形態では、本mRNAは、イソシトシン、プソイドイソシトシン、5−ブロモウラシル、5−プロピニルウラシル、6−アミノプリン、2−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、及び2−クロロ−6−アミノプリンシトシン、ならびにこれらの修飾及び他の核酸塩基の修飾の組み合わせから選択される、1つ以上の非標準的ヌクレオチド残基を含み得る。ある特定の実施形態は、フラノース環または核酸塩基に対する追加の修飾をさらに含み得る。追加の修飾としては、例えば、糖修飾または置換(例えば、2’−O−アルキル修飾、ロックド核酸(LNA)のうちの1つ以上)が挙げられる。いくつかの実施形態では、本RNAは、追加のポリヌクレオチド及び/またはペプチドポリヌクレオチド(PNA)で複合もしくはハイブリッド形成され得る。糖修飾が2’−O−アルキル修飾である実施形態では、かかる修飾としては、2’−デオキシ−2’−フルオロ修飾、2’−O−メチル修飾、2’−O−メトキシエチル修飾、及び2’−デオキシ修飾が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、これらの修飾のいずれも、ヌクレオチドの0〜100%、例えば、個別または組み合わせで、構成ヌクレオチドの0%超、1%、10%、25%、50%、75%、85%、90%、95%、または100%において存在し得る。
CFTR mRNAを含む組成物
ある特定の実施形態では、本発明のmRNA分子は、裸または未包装のmRNAとして投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物中のmRNAの投与は、好適な担体の包含によって促進され得る。ある特定の実施形態では、該担体は、標的細胞への1つ以上のmRNAのトランスフェクションを促進するその能力に基づいて選択される。
本明細書において使用される場合、用語「担体」は、一般的に、mRNAを含む、生物活性剤の投与に関連する使用のために意図される、標準的な薬学的担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤などのうちのいずれかを含む。
ある特定の実施形態では、本発明の組成物中に用いられる該担体は、リポソーム小胞、または標的細胞及び/もしくは組織へのmRNAの移動を促進するための他の手段を含み得る。好適な担体としては、ポリマー系担体、例えばポリエチレンイミン(PEI)及びマルチドメインブロックポリマー、脂質ナノ粒子及びリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然エキソソーム及び合成的に誘導されたエキソソームの両方、天然、合成、及び半合成の層状体、ナノ微粒子、ケイ酸カルシウム蛍光体ナノ微粒子、リン酸カルシウムナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ微粒子、乾燥粉末、ポリ(D−アルギニン)、ナノデンドリマー、デンプンベースの送達系、ミセル、乳濁液、ゾルゲル、ニオソーム、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、ペプチド抱合体、小分子標的抱合体、ならびに他のベクタータグが挙げられるが、これらに限定されない。好適な担体としてのバイオナノカプセル及び他のウイルス性カプシドタンパク質アセンブリの使用も企図される。(Hum.Gene Ther.2008 Sep;19(9):887−95)。
いくつかの実施形態では、該担体は、カチオン性脂質またはカチオン性有機ポリマーなどの有機カチオンを含む。存在する場合、カチオン性脂質は、mRNAを被包するリポソーム小胞の構成要素であり得る。
本発明のある特定の実施形態では、該担体は、担体としてのポリマーを、単独で、または他の担体と組み合わせて使用して製剤化される。好適なポリマーとしては、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキシアノアクリレート、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギン酸、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、PEG化プロタミン、PLL、PEG化PLL、及びポリエチレンイミン(PEI)を挙げることができる。PEIが存在するとき、それは、10〜40kDaの範囲の分子量の分岐状PEI、例えば、25kDaの分岐状PEI(Sigma 408727番)であり得る。本発明のために好適な追加の例示的なポリマーとしては、PCT公開第WO2013182683号に記載のものが挙げられ、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
標的細胞へのポリヌクレオチドの送達を促進するためのリポソーム担体の使用は、本発明によって企図される。リポソーム(例えば、リポソーム脂質ナノ粒子)は、一般的に、様々な研究、産業、及び医学における応用において、特に診断用または治療的化合物の担体としてのインビボのそれらの使用のために有用であり(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307−321,1998、Drummond et al.,Pharmacol.Rev.,51:691−743,1999)、通常は、1つ以上の二重層の膜によって外部培地から隔絶された内部水性空間を有する微視的な小胞として特徴付けられる。リポソームの二重膜は、典型的に、両親媒性分子、例えば、空間的に分離した親水性及び疎水性ドメインを含む合成または天然起源の脂質などによって形成される(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307−321,1998)。リポソームの二重膜は、両親媒性ポリマー及び界面活性物質(例えば、ポリメロソーム、ニオソームなど)によっても形成され得る。
ある特定の実施形態では、本mRNAは、標的細胞への送達を促進するために脂質ナノ粒子と複合される。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、1つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質(ヘルパー脂質とも称される)などの追加の脂質、コレステロール系脂質、及び/またはmRNA被包のためのPEG化脂質を用いる多構成要素の脂質混合物と組み合わされる場合がある。
カチオン性脂質
いくつかの実施形態では、好適な脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を含有する。本明細書において使用される場合、語句「カチオン性脂質」は、選択されたpH、例えば生理的pHにおいて正味の正電荷を有する、ある数の脂質種のうちのいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質、特に、滴定可能またはpH滴定可能なカチオン性脂質として知られるものが、mRNAを送達するに当たって特に有効である。いくつかのカチオン性(例えば、滴定可能)脂質が文献に記載されており、その多くは市販されている。本発明の組成物及び方法において使用するために特に好適なカチオン性脂質としては、国際特許公開第WO2010/053572号(そして特に、段落[00225]に記載されるC12−200)ならびに国際公開第WO2012/170930号に記載のものを含み、この両方が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質cKK−E12が使用され(国際公開第WO2013/063468号に開示される)、その教示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質N−[1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル]−N,N,N−塩化トリメチルアンモニウム、すなわち「DOTMA」が使用される。(Feigner et al.(Proc.Nat’l Acad.Sci.84,7413(1987)、米国特許第4,897,355号)。DOTMAは、単独で、または中性脂質、ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミンもしくは「DOPE」、または他のカチオン性もしくは非カチオン性脂質と組み合わせて、リポソーム移動ビヒクルまたは脂質ナノ粒子へと製剤化され得、かかるリポソームは、標的細胞への核酸の送達を向上させるために使用され得る。他の好適なカチオン性脂質としては、例えば、5−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド、すなわち「DOGS」、2,3−ジオレイルオキシ−N−[2(スペルミン−カルボアミド)エチル]−N,N−ジメチル−1−プロパンアミニウム、すなわち「DOSPA」(Behr et al.Proc.Nat.’l Acad.Sci.86,6982(1989)、米国特許第5,171,678号、米国特許第5,334,761号)、1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアンモニウム−プロパン、すなわち「DODAP」、1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン、すなわち「DOTAP」が挙げられる。企図されるカチオン性脂質としては、1,2−ジステアリルオキシ−N,N−ジメチル−3−アミノプロパン、すなわち「DSDMA」、1,2−ジオレイルオキシ−N,N−ジメチル−3−アミノプロパン、すなわち「DODMA」、1,2−ジリノレイルオキシ−N,N−ジメチル−3−アミノプロパン、すなわち「DLinDMA」、1,2−ジリノレニルオキシ−N,N−ジメチル−3−アミノプロパン、すなわち「DLenDMA」、N−ジオレイル−N,N−ジメチルアンモニウム塩化物、すなわち「DODAC」、N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウム臭化物、すなわち「DDAB」、N−(1,2−ジミリスチルオキシプロプ−3−イル)−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウム臭化物、すなわち「DMRIE」、3−ジメチルアミノ−2−(コレスト−5−エン−3−β−オキシブタン−4−オキシ)−1−(シス,シス−9,12−オクタデカジエンオキシ)プロパン、すなわち「CLinDMA」、2−[5’−(コレスト−5−エン−3−β−オキシ)−3’−オキサペントキシ)−3−ジメチル1−1−(シス,シス−9’,1−2’−オクタデカジエンオキシ)プロパン、すなわち「CpLinDMA」、N,N−ジメチル−3,4−ジオレイルオキシベンジルアミン、すなわち「DMOBA」、1,2−N,N’−ジオレイルカルバミル−3−ジメチルアミノプロパン、すなわち「DOcarbDAP」、2,3−ジリノレオイルオキシ−N,N−ジメチルプロピルアミン、すなわち「DLinDAP」、1,2−N,N’−ジリノレイルカルバミル−3−ジメチルアミノプロパン、すなわち「DLincarbDAP」、1,2−ジリノレオイルカルバミル−3−ジメチルアミノプロパン、すなわち「DLinCDAP」、2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキソラン、すなわち「DLin−−DMA」、2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノエチル−[1,3]−ジオキソラン、すなわち「DLin−K−XTC2−DMA」、及び2−(2,2−ジ((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イル)−1,3−ジオキソラン−4−イル)−N,N−ジメチルエタンアミン(DLin−KC2−DMA))(国際公開第WO2010/042877号、Semple et al.,Nature Biotech.28:172−176(2010)を参照されたい)、またはこれらの混合物も挙げられる。(Heyes,J.,et al.,J Controlled Release 107:276−287(2005)、Morrissey,DV.,et al.,Nat.Biotechnol.23(8):1003−1007(2005)、PCT公開第WO2005/121348A1号)。
ある特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、2013年3月29日提出の米国仮特許出願第61/617,468号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載のイオン化可能なカチオン性脂質、例えば、(15Z,18Z)−N,N−ジメチル−6−(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イル)テトラコサ−15,18−ジエン−1−アミン(HGT5000)、(15Z,18Z)−N,N−ジメチル−6−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イル)テトラコサ−4,15,18−トリエン−1−アミン(HGT5001)、及び(15Z,18Z)−N,N−ジメチル−6−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イル)テトラコサ−5,15,18−トリエン−1−アミン(HGT5002)を含む、脂質ナノ粒子を用いる。
いくつかの実施形態では、かかる組成物中に存在するカチオン性脂質のうちの1つ以上は、イミダゾール、ジアルキルアミノ、またはグアニジウム部分のうちの少なくとも1つを含む。好ましい実施形態では、カチオン性脂質のうちの1つ以上は、四級アミンを含まない。
非カチオン性/ヘルパー脂質
いくつかの実施形態では、好適な脂質ナノ粒子は、1つ以上の非カチオン性(「ヘルパー」)脂質を含有する。本明細書において使用される場合、語句「非カチオン性脂質」は、中性脂質、双性イオン性、またはアニオン性脂質のいずれかを指す。本明細書において使用される場合、語句「アニオン性脂質」は、選択されたpH、例えば生理的pHにおいて正味の負電荷を帯びる、ある数の脂質種のうちのいずれかを指す。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、中性脂質、すなわち、本組成物が製剤化及び/または投与される条件下で正味電荷を帯びない脂質である。非カチオン性脂質としては、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレート(DOPE−mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン(DSPE)、16−O−モノメチルPE、16−O−ジメチルPE、18−1−トランスPE、1−ステアロイル−2−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン(SOPE)、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
コレステロールベースの脂質
いくつかの実施形態では、好適な脂質ナノ粒子は、1つ以上のコレステロールベースの脂質を含む。例えば、好適なコレステロールベースのカチオン性脂質としては、例えば、コレステロール、PEG化コレステロール、DC−Choi(N,N−ジメチル−N−エチルカルボアミドコレステロール)、1,4−ビス(3−N−オレイルアミノ−プロピル)ピペラジン(Gao,et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)、Wolf et al.BioTechniques 23,139(1997)、米国特許第5,744,335号)、またはICEが挙げられる。
PEG化脂質
いくつかの実施形態では、好適な脂質ナノ粒子は、1つ以上のPEG化脂質を含む。例えば、ポリエチレングリコール(PEG)修飾リン脂質、及びN−オクタノイル−スフィンゴシン−1−[サクシニル(メトキシポリエチレングリコール)−2000](C8 PEG−2000セラミド)を含む誘導体化セラミド(PEG−CER)などの誘導体化脂質の使用は、カチオン性脂質のうちの1つ以上、そしていくつかの実施形態では他の脂質との組み合わせで、本発明によって企図される。いくつかの実施形態では、好適なPEG化脂質は、より短いアシル鎖(例えば、C14またはC18)を有するPEG−セラミドを含む。いくつかの実施形態では、PEG化脂質DSPE−PEG−マレイミド−レクチンが使用され得る。他の企図されるPEG修飾脂質としては、C〜C20長のアルキル鎖(複数可)を有する脂質に共有結合された、長さが最大5kDaのポリエチレングリコール鎖が挙げられるが、これに限定されない。特定の理論に制限されることを望むものではないが、PEG化脂質の付加は、複合体の凝集を防止し、循環の寿命を増加させ、リポソームで被包されたmRNAの標的細胞への送達を促進し得ることが企図される。
ある特定の実施形態では、本組成物は、以下の脂質の組み合わせのうちの1つを含む:
C12−200、DOPE、コレステロール、DMG−PEG2K、
DODAP、DOPE、コレステロール、DMG−PEG2K、
HGT5000、DOPE、コレステロール、DMG−PEG2K、
HGT5001、DOPE、コレステロール、DMG−PEG2K、
XTC、DSPC、コレステロール、PEG−DMG、
MC3、DSPC、コレステロール、PEG−DMG、
ALNY−100、DSPC、コレステロール、PEG−DSG、
cKK−E12、DOPE、Chol、PEGDMG2K。
いくつかの実施形態では、脂質:mRNA比は、5:1(mg:mg)、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、及びそれ以上から最大30:1(mg:mg)、またはそれ以上であり得る。N/P比は、1.1:1から最大10:1の範囲内、またはそれ以上であり得る。脂質比の例は、40:30:20:10、55:20:20:5、50:25:20:5(カチオン性脂質:ヘルパー脂質:chol:PEG脂質)である。
いくつかの実施形態では、本発明に従う薬学的組成物は、粘液溶解剤(例えば、N−アセチルシステイン、エルドステイン、ブロムヘクシン(bromheksin)、カルボシステイン、グイアフェネシン(guiafenesin)、またはヨウ素化グリセロール)を含まない。
薬学的組成物が装填された装置
いくつかの実施形態では、非自然発生的CFTR mRNAを含むカチオン性脂質ベースまたはPEIベースの組成物などの、本発明に従う薬学的組成物は、対象の呼吸器系への投与のための装置において提供される。本装置は、例えば、滴下、エアロゾル化、または噴霧装置であり得る。好適な装置としては、例えば、PARI Boyジェット噴霧器、Aeroneb(登録商標)実験室噴霧器、MicroSprayer(登録商標)、またはEFlowメッシュ噴霧器が挙げられる。あるいは、携帯型吸入器などの乾燥粉末吸入器またはエアロゾル化装置が使用され得る。
使用及び方法
本発明に従う使用及び方法のためのmRNA
とりわけ、本発明は、特に哺乳動物の肺における、CFTRタンパク質のインビボの産生方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、哺乳動物の肺における上皮細胞中のCFTR発現の誘導方法であって、該上皮細胞をインビトロ転写mRNAを含む薬学的組成物と接触させることを含む、方法を提供し、該インビトロ転写mRNAは、配列番号1(野生型ヒトCFTRのアミノ酸配列)をコードするコード配列を含む。本発明はまた、哺乳動物の肺における上皮細胞中のCFTR発現の誘導のための、インビトロ転写mRNAを含む薬学的組成物の使用を提供し、該インビトロ転写mRNAは、配列番号1をコードするコード配列を含む。
本発明は、哺乳動物の標的細胞中のCFTR発現の誘導方法をさらに提供し、本方法は、哺乳動物の標的細胞を組成物と接触させることを含み、本組成物は、配列番号1のアミノ酸配列をコードするインビトロ転写mRNAを含む。本発明は、哺乳動物の標的細胞中のCFTR発現の誘導のための組成物の使用をさらに提供し、本組成物は、配列番号1のアミノ酸配列をコードするインビトロ転写mRNAを含む。
かかる使用及び治療方法のいくつかの実施形態では、インビトロ転写mRNAは、ヒトCFTR(配列番号2)をコードする自然発生的または野生型mRNAである。他の実施形態では、インビトロ転写mRNAは、上述の非自然発生的mRNAである。
ある特定の実施形態では、インビトロ転写mRNAは、配列番号2(野生型ヒトCFTR mRNAコード配列)と少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、88%、90%、92%95%、または100%同一である配列番号1をコードするコード配列を含む。
配列番号2と少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%同一である配列番号1をコードするコード配列を含むmRNAは、上述の本mRNAよりも多いクリプティックプロモーター、直列反復及び逆方向反復、ならびに/またはGC含量を有し得る。配列番号2を含むベクターは、典型的な成長条件下で、宿主細胞中の挿入/欠失/再配列変異を頻繁に経験し、インビトロ転写のために直接的に使用され得なかったベクターの異種性の集団をもたらしたことが観察された。より低い温度、落ち着いた光、及び/または低コピー細胞、例えばCopyCutter(登録商標)などの条件下で成長する宿主細胞は、変異の発生を低減させたが排除しなかったことが分かった。したがって、配列番号2と少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%同一のコード配列を含むmRNAのインビトロ転写反応には、上述のベクターを成長させることによって得られる鋳型を使用し、このベクターを収集及び直線化し、転写反応において使用するための所望の種を精製することが賢明な場合がある。精製ステップは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィまたは弱アニオン交換であり得る。
本発明に従う使用及び方法のためのインビトロ転写mRNAは、かかる特徴に関する上記の項で記述される通り、5’−UTR、3’UTR、ポリA、ポリU、及び/もしくはポリCテール、キャップ、ならびに/または非標準的ヌクレオチド残基を含み得る。
使用及び方法のための薬学的組成物
本発明に従う使用のための薬学的組成物は、前項で記述された本発明に従う使用及び方法のためのmRNA、ならびにCFTR mRNAを含む組成物に関する上記の項で記述された追加の成分を含み得る。したがって、上述の担体のいずれかを含む薬学的組成物の使用及び/または投与が企図される。
いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物は、10〜40kDaの範囲、例えば、25kDaの分子量を有する分岐状PEIなどのPEIを含む。
他の好ましい実施形態では、薬学的組成物は、カチオン性脂質、PEG化脂質、及び追加の脂質(中性脂質など)を含む。カチオン性脂質、PEG化脂質、及び/または追加の脂質は、CFTR mRNAを含む組成物に関する上記の項に列記されるものから選択され得る。
肺における発現の誘導のための投与経路
哺乳動物の肺におけるCFTR発現の誘導のための方法及び使用のいくつかの実施形態では、上述の薬学的組成物は、気管内滴下、噴霧、及びエアロゾル化から選択される経路によって投与される。本組成物を投与するための装置は、薬学的組成物が装填された装置に関する上記の項に列記される装置から選択され得る。
好ましい実施形態では、本組成物は、噴霧またはエアロゾル化を介して投与される。いくつかの脂質製剤は、噴霧が試みられる際に凝集する傾向を有し得るが、配合を調整すること、例えば、カチオン性脂質を置換することによって、凝集の問題を解決することが一般的に可能である。
嚢胞性線維症の治療
とりわけ、本発明は、嚢胞性線維症を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象に、本明細書に記載のCFTRタンパク質をコードするmRNA、または本mRNAを含有する薬学的組成物を投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。本mRNAまたは本mRNAを含有する薬学的組成物は、対象の肺に直接投与され得る。肺送達のための様々な投与経路が使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のmRNAまたはmRNAを含有する組成物は、吸入、噴霧、またはエアロゾル化によって投与される。様々な実施形態では、本mRNAの投与は、対象の肺(例えば、肺の上皮細胞)におけるCFTRの発現をもたらす。
特定の実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象の肺に、配列番号1をコードするコード配列を含むmRNAを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象の肺に、配列番号1と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列をコードするコード配列を含むmRNAを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。別の特定の実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象の肺に、配列番号3のコード配列を含むmRNAを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象の肺に、配列番号3と少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%同一のコード配列を含むmRNAを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。嚢胞性線維症を治療するために使用され得る追加の例示的な非自然発生的CFTR mRNA、例えば、配列番号9、10、11、12、13、14、15、16、または17などは、配列の簡単な説明の項に記載される。いくつかの実施形態では、嚢胞性線維症を治療するために使用され得る非自然発生的CFTR mRNAは、配列番号3、9、10、11、12、13、14、15、16、または17のうちのいずれかと、少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一のコード配列を含む。
実施例
以下の具体的な実施例は単なる例示であり、本開示の残部をいかようにも制限するものではないと解釈されるべきである。さらなる詳細を伴わずに、当業者であれば、本明細書の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。
別途指示されない限り、本明細書に開示される実施例において使用されるCFTR mRNA及びSNIM RNAは、配列番号4の配列を有する5’UTR、配列番号3の配列を有するコード配列(CDS)、及び配列番号5の配列を有する3’UTRを含んだ。本明細書に開示される実施例において使用されるFFL mRNA及びSNIM RNAは、それぞれ配列番号6、7、及び8の配列を有する5’UTR、CDS、及び3’UTRを含んだ。
実施例1:インビトロ合成されたCFTRをコードするmRNA
伝令RNA合成。ヒト嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子(CFTR)mRNA、及びホタルルシフェラーゼ(FFL)mRNAを、遺伝子をコードするプラスミドDNA鋳型からインビトロ転写によって合成し、続いて、5’キャップ構造(キャップ1)(Fechter,P.;Brownlee,G.G.“Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins”J.Gen.Virology 2005,86,1239−1249)、及び、ゲル電気泳動によって決定されたときに長さがおよそ200のヌクレオチドの3’ポリ(A)テールを付加した。5’及び3’の非翻訳領域が各mRNA産物中に存在した。
例示的な非自然発生的CFTR mRNAとしては、配列の簡単な説明の項に記載の配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、または配列番号17が挙げられる。
実施例2:HEK細胞中のCFTR発現及び活性
この実施例は、細胞に送達される合成ヒトCFTR mRNAから完全に機能的なCFTRタンパク質が発現されることを実証する。
細胞及びCFTRトランスフェクション。ヒト胎児腎臓HEK293T細胞を、10%のウシ胎仔血清、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン、及び100μg/mlのストレプトマイシンを追加したDMEM(Invitrogenカタログ番号11965−092)内で成長させた。トランスフェクションの前日に、50〜60%コンフルエンスの6ウェルプレートに細胞をプレーティングし、正常組織培養条件下(5%のCO2、95%の空気の加湿雰囲気中で36℃)でインキュベートした。60μlのLipofectamine 2000(Invitrogenカタログ番号11668019)を、900μlのOptiMem低血清培地(Invitrogenカタログ番号31985−062)中で希釈し、穏やかにボルテックスした。24μgのCFTR mRNA(プレート当たり4μg)を、900μlのOptiMem培地中で希釈した。このmRNAを、希釈したLipofectamineに直ちに添加し、室温で30分間インキュベートした。プレーティング培地を、HEK293T細胞から穏やかに吸引し、1mlのOptiMem低血清培地と交換した。300μlのmRNA/Lipofectamine複合体を各ウェルに加え、細胞を正常組織培養条件下に24時間置き、その後、細胞を電気生理学的記録のための記録チャンバに容易に移動できるように、機械的解離によってポリ−L−リジンでコーティングされたガラスカバースリップ(BD Biosciences、BD Biocoat)に再度プレーティングした。細胞を、最低でさらに24時間にわたって標準的な組織培養条件下でインキュベートし、最終のプレーティングの48時間以内に使用した。
電気生理学的記録。5〜8MΩの電極を有するAxopatch 200B増幅器を使用して、全細胞パッチ固定記録を室温で行った。データを適切にデジタル化し(50kHz)、フィルタリングした(5kHz)。直列抵抗を補正し(70〜80%)、電圧誤差を最小化した。以下の組成のピペット溶液を用いて、電圧固定記録を実施した:140mMのNMDG−Cl、5mMのEGTA、1mMのMgCl2、10mMのHEPES、pH7.2、310mOsm/l。浴液は、D−グルコースで315mOsm/lに調整された140mMのNaCl、3mMのKCl、2mMのMgCl2、2mMのCaCl2、及び10mMのHEPES、pH7.3を含有した。電圧固定記録を、全細胞構成の確立の3〜5分後に開始した。
細胞を、−60mVまたは0mVのいずれかの保持電位で電圧固定し、記録されるHEK293T細胞に一連の正電圧及び負電圧ステップ(20mVの増分において−80mV〜+80mVまたは−100〜+100mVのいずれか)を注入し、CFTRに誘導された全細胞塩素イオン(Cl−)電流を誘起した。cAMPの膜透過性類似体、8−Br−cAMP(500μM、Sigma Aldrich)を、記録される細胞に4分間適用し、CFTR電流を促進した。「ゴールドスタンダード」のCFTRブロッカー、CFTRinh−172(10μM、Sigma)を、各記録の終わりに適用し、CFTRに誘導されたCl−電流を遮断した。対照記録を、非トランスフェクトHEK293T細胞中で実施した。
試験化合物。記録される細胞からおよそ200μmに配置された排出ピペットを用いる、DAD−16VC急速灌流システム(ALA Scientific Instruments、USA)を使用して、試験化合物を適用した。8−Br−cAMPをddH20中500mMのストック濃度として作製した。CFTRinh−172をDMSO中10mMのストックとして作製した。全化合物を−20℃で保管し、使用直前に急速に解凍して所望の最終濃度に希釈した。
分析。Clampfit(MDS Analytical Technologies)及びExcel(Microsoft)ソフトウェアを使用して全分析を行った。すべての値は、最大の誘起されたピーク電流振幅である。データの統計的差異を、必要に応じて対応または独立のスチューデントt検定によって評価し、P<0.05で有意と見なした。
インビトロのヒトCFTRタンパク質産生。hCFTR mRNAを介するヒトCFTRタンパク質の産生を、本明細書に記載のHEK293T細胞中のヒトCFTR mRNAのトランスフェクションを介して達成した。処置済及び無処置の細胞を収集し、トランスフェクションの24時間後に免疫沈降法を行った。ウェスタンブロット分析を介するヒトCFTRタンパク質の検出は、完全複合のグリコシル化CFTRタンパク質(「C」バンドとして示される)が、合成伝令RNAから産生されたことを実証する(図1A)。
インビトロのヒトCFTRタンパク質活性。トランスフェクション後に産生された合成ヒトCFTR mRNA由来のCFTRタンパク質の活性を決定するため、HEK 293及びHEK 293T細胞の両方で全細胞パッチ固定アッセイを実施した。電流の流れ(塩素イオン輸送)の変化の決定を助けるために、処置細胞ならびに対照細胞(無処置及び偽トランスフェクトされた)を、活性化剤(8−Br−cAMP、ホルスコリン)及び阻害剤(CFTRinh−172、GlyH−101)基質に晒した。
HEK293T細胞に、4ugのhCFTR mRNAをトランスフェクトし、トランスフェクションの24時間後に分析した。全細胞固定アッセイを行い、既定の電圧の適用時の塩素イオン輸送によって表される電流の流れを測定した。−80mV〜+80mVの電圧ランプの結果としての電流対電圧のプロット(図2に示される)は、無処置細胞とhCFTR mRNAで処置された細胞とを比較したときの電流の実質的差異を示す。CFTRタンパク質の既知の活性化剤である8−Br−cAMPへの曝露後の電流のこの増加は、ヒトCFTRタンパク質がこれらの細胞中に存在することを示唆する。これらの以前にトランスフェクトされた細胞を、既知のCFTR阻害剤、CFTRinh−172を用いて処置すると、それぞれの電流は、対照レベル近くまで低下する(約89%の減少)。この阻害剤の曝露後のかかる減少は、ヒトCFTRタンパク質の存在を強く支持する。これらの結果は、総じて、合成hCFTR mRNAが活性ヒトCFTRタンパク質を産生し得ることを実証する。
別々に、HEK293細胞中で自動化システム(IonWorks)を使用して、CFTR全細胞活性アッセイを実施した。上述の通り、電流の流れ(塩素イオン輸送)の変化の決定を助けるために、処置細胞ならびに対照細胞(無処置及び偽トランスフェクトされた)を、活性化剤及び阻害剤基質に晒した。これらの研究では、CFTRタンパク質活性化剤としてホルスコリンを用い、hCFTR mRNAのトランスフェクト細胞の一部を、異なる特異的CFTR阻害剤、GlyH−101にさらに曝露した。GlyH−101は、タンパク質の細胞外膜側に作用する、CFTR細孔ブロッカーとして作用すると考えられる。特に、この機構の作用は、CFTRタンパク質の細胞内側から機能すると報告されているCFTRinh−172のものとは異なる。
図4は、ホルスコリンならびにGlyH−101で処置された親のHEK293細胞株の電流−電圧プロットを表す。電流の著しい変化は測定されず、これらの特異的CFTR活性化剤/阻害剤が、細胞株中に存在する内在性タンパク質に影響を有しないことを示唆する。
−100mV〜+100mVの電圧ランプの結果としての電流対電圧のプロット(図5に示される)は、無処置HEK293細胞とhCFTR mRNAで処置された細胞とを比較したときの電流の実質的差異を示す。CFTRタンパク質の既知の活性化剤であるホルスコリンへの曝露後の電流のこの増加は、ヒトCFTRタンパク質がこれらの細胞中に存在することを示唆する。これらの以前にトランスフェクトされた細胞を、異なる既知の特異的CFTR阻害剤、GlyH−101を用いて処置すると、それぞれの電流は、対照レベル近くまで低下する(約95%の減少)。この阻害剤の曝露後のかかる減少は、ヒトCFTRタンパク質の存在を強く支持する。
総じて、2つの明確に異なる機構の結果であるこれらの阻害データは、合成ヒトCFTR伝令RNAに由来する完全に機能的なCFTRタンパク質の同一性を強く支持する。
実施例3:CFTRのインビボの発現
この実施例は、CFTRタンパク質が、肺内投与によって送達されるCFTRをコードするmRNAから、インビボで有効に発現されることを実証する。
製剤化プロトコル1。C12−200、DOPE、Chol、及びDMG−PEG2Kの50mg/mLのエタノール溶液のアリコートを混合し、3mLの最終容積までエタノールで希釈した。別々に、CFTR mRNAの水性緩衝液(10mMのクエン酸/150mMのNaCl、pH4.5)を、1mg/mLのストックから調製した。脂質溶液を水性mRNA溶液に急速に注入し、振盪し、20%のエタノール中の最終懸濁液を得た。結果として生じるナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)、続いて水で透析濾過(diafiltrate)し、濃縮し、2〜8℃で保管した。最終濃度=1.09mg/mLのCFTR mRNA(被包されている)。Z平均=80.2nm(Dv(50)=55.5nm;Dv(90)=99.6nm)。
製剤化プロトコル2。2.0mg/mLの水溶液PEI(分岐状、25kDa)のアリコートを、CFTR mRNA(1.0mg/mL)の水溶液と混合した。結果として生じる複合混合物を、上下に数回ピペッティングし、注射前に20分間置いた。最終濃度=0.60mg/mLのCFTR mRNA(被包されている)。Z平均=75.9nm(Dv(50)=57.3nm;Dv(90)=92.1nm)。
mRNAが充填されたナノ粒子の気管内投与を介して産生されたFFL及びCFTRタンパク質の分析。雌のBALB/CマウスまたはCFTR KOマウスのいずれかを使用して、すべての研究を実施した。FFL試料を、各用量の被包されたFFL mRNAの直接滴下(MicroSprayer(登録商標))または噴霧(PARI BoyもしくはAeroneb)のいずれかを介して導入した。PARI Boyジェット噴霧器を使用して、CFTR mRNAを導入した。マウスを屠殺し、発現のための時間を持った後、生理食塩水で灌流した。
FFL mRNAの気管内投与。ケタミン50〜100mg/kg及びキシラジン5〜15mg/kgの混合物を用い、腹腔内注射で動物を麻酔しながら、Microsprayer(商標)を介する単一の気管内エアロゾル投与(50μL/動物)によって、FFL試験材料を投与した。
FFL mRNAの噴霧(エアロゾル)投与。Aeroneb(登録商標)実験室噴霧器を介する単一のエアロゾル吸入(最大8mL/群の通常用量容積)によって、FFL試験材料を投与した。試験材料を、動物の全群を収容するボックス(n=4)に送達し、酸素流及び捕捉システムに接続した。
CFTR mRNAの投与。以下の実施例6に記載の方法でCFTR mRNAを調製した。4匹のCFTRノックアウトマウスをエアロゾルチャンバボックスに配置し、およそ1時間にわたる噴霧(Pari Boyジェット噴霧器)を介して、2mgの全コドンを最適化した無修飾ヒトCFTR mRNA(配列番号3のコード配列を含む)に曝露した。曝露の24時間後にマウスを屠殺した。
安楽死。動物を、用量投与(±5%)後の代表的な時間にCO窒息によって安楽死させ、続いて開胸及び全採血を行った。心穿刺を介して全血(最大の入手可能な容積)を採取し、廃棄した。
灌流。全採血後、全動物は、生理食塩水を用いた心臓灌流を受けた。手短に言えば、灌流のために左心室の管腔内に置かれた生理食塩水を含む10mLのシリンジに取付けられた23/21ゲージの針を挿入することによって、全身の心臓内灌流を実施した。右心房を切開し、灌流液の排液口を提供した。穏やかで安定した圧力をプランジャーに適用し、針を心臓内に配置した後、動物を灌流した。フラッシング溶液が身体を飽和し、手順が完了したことを示すように、出てくる灌流液が澄んで(目に見える血液がなく)流れるとき、十分な流量のフラッシング溶液を確保した。
組織採取。灌流後、全動物の肝臓ならびに肺(右及び左)を収集した。選択群の肝臓のおよそ半分ならびに両方(右及び左)の肺を液体窒素中で即座に凍結し、名目上−70℃で別々に保管した。選択群の肝臓のおよそ半分を、動物1匹当たり1つの組織学カセットに配置した。さらに、気管に挿入したカニューレを通して、10%のNBFで肺を膨張させた。気管を結紮で縛り、肺(右及び左)ならびに気管を、動物1匹当たり1つの組織学カセットにインタクトに配置した。すべての組織学カセットを、10%のNBF中で24時間、環境条件で保管し、70%のエタノールに移動させた。
FFL処置マウスにおけるFFLの発現。組織試料の分析時に、FFL処置マウスにおいてFFL発現を検出した(データは示さず)。
CFTRノックアウトマウスにおけるCFTRの発現。CFTR mRNA処置マウス肺の免疫沈降ウェスタンブロット分析によって、CFTR発現を検出した。成熟型「C」バンドは、対照マウスでは観察されなかった一方で、すべての処置マウスの左及び右の肺において検出された(図1B)。使用した抗体は、免疫沈降についてはMAB25031(R&D Systems)、そしてウェスタンブロット分析を介する検出についてはSAB4501942(Sigma)であった。
ここに示される結果は、CFTRタンパク質が、mRNAの肺送達に基づいて、インビボで成功裏に発現され得ることを示す。さらに、CFTR mRNAがCFTRノックアウトマウスの肺に成功裏に送達され、肺における有効なタンパク質産生をもたらしたという事実は、CFTR mRNAベースのインビボのタンパク質産生が、CFTRタンパク質欠乏症を治療するために使用され得ることを示す。
実施例4:ポリマーナノ粒子を使用するCFTR mRNAの肺送達
マウスの肺へのヒトCFTR伝令RNAの送達は、直接吸入ならびに噴霧のいずれかを介して達成され得る。インサイツのハイブリダイゼーション方法を使用すると、ヒトCFTR mRNAが充填されたナノ粒子をマウスに気管内投与した後、ヒトCFTR mRNAを成功裏に検出することができる。投与は、脂質ベースのナノ粒子(例えば、C12−200)ならびにポリマーナノ粒子(例えば、ポリエチレンイミン、PEI)を用いて達成され得る。
ポリマーナノ担体を使用するCFTR mRNAの投与。CFTR KOマウスを、気管内投与(30ugの被包されたmRNA)を介して、ポリエチレンイミン(PEI)ベースのCFTR mRNAが充填されたナノ粒子で処置した。投与の6時間後及び24時間後に処置マウスを屠殺し、肺を収集して10%の中性緩衝ホルマリン(NBF)中で固定した。外来性ヒトCFTR mRNAの検出のために、インサイツのハイブリダイゼーションを用いた(図6)。PBSで処置された対照マウスでは染色が観察されなかった一方で、処置されたCFTR KOマウスの両方のマウスの肺では、広範な分布を伴って投与の24時間後に実質的な染色が観察された。
より高拡大率(最大20倍の拡大率)での処置された肺の分析は、両方の肺の気管支及び肺胞の領域全体にわたる広範な陽性細胞内染色を明らかにした(図7)。さらなる拡大率(40倍)では、標的の頂端気管支上皮細胞の細胞質中で陽性染色が観察された(図8)。したがって、伝令RNA APIが、標的の頂端気管支上皮細胞に成功裏に送達されたと結論付けることができる。さらに、実質的な染色が投与の6時間後において観察され得る一方で、hCFTR mRNAの有意な陽性検出は24時間後に依然として観察された(図9)。
実質的な陽性細胞内染色は、投与の24時間後において、両方の肺全体で気管支及び肺胞の領域内に観察された。
実施例5:脂質ベースのナノ粒子を使用するCFTR mRNAの肺送達
脂質ベースのナノ担体を使用するCFTR mRNAの投与。上述の通り、ヒトCFTR mRNAの成功裏の肺送達は、脂質ナノ粒子ベースの送達ビヒクルを介して達成され得る。カチオン性脂質構成要素としてC12−200を利用する、hCFTR mRNAが充填されたカチオン性脂質ナノ粒子の実施例がここに開示される。
CFTR KOマウスの肺内のヒトCFTR mRNAの成功裏の検出は、インサイツのハイブリダイゼーションを介して達成された。ノックアウトマウスを、C12−200ベースの脂質ナノ粒子中に被包された15ugのhCFTR mRNAで処置し、投与の6時間後に屠殺した。PBSで処置された対照マウスと比較した場合、hCFTR mRNAの陽性検出が、両方の肺の気管支及び肺胞の領域全体で観察された(図10)。
さらなる拡大率(40倍)では、気管支上皮細胞の頂端細胞質中、ならびに細胞内末端肺胞領域内で、ヒトCFTR mRNAの陽性検出が観察された(図11)。
総じて、合成ヒトCFTR伝令RNAの成功裏の送達は、ポリマー(PEI)及び脂質ナノ粒子ベース(C12−200)の送達系の両方を利用して達成され得る。これらの送達系は、マウスの標的細胞中の原体の細胞内蓄積をもたらした。さらに、実質的な量のhCFTR mRNAが、投与の24時間後にこれらの標的細胞中に存在した。
実施例6:特異的抗体を使用するヒトCFTR発現の検証
マウス、ブタ、及び培養細胞におけるヒトCFTRタンパク質検出のための抗体検証。hCFTRタンパク質に特異的であり、マウス及びブタ類似体と交差反応せず、かつ将来の実験のために十分な供給が利用可能である抗体を同定するために、実験を実施した。手短に言えば、学術的及び商業的供給源からの様々な抗hCFTR抗体の試験は、マウスまたはブタCFTRのいずれかに対する交差反応性を伴わずに、免疫沈降及びウェスタンブロッティング(IP/WB)後のヒトCFTRタンパク質を検出することができた抗hCFTR抗体の組み合わせの同定につながった。したがって、マウスまたはブタCFTRのいずれかに対する交差反応性を伴わないhCFTRタンパク質の検出のための好適な抗hCFTR抗体が、IP/WB結果に基づいて同定された。
細胞にhCFTR mRNAをトランスフェクトし、トランスフェクションの24時間後において、ProteoExtract膜貫通キット(Merck)を使用してタンパク質ライセートを調製し、マウス抗ヒトCFTR抗体(MA1−935)を使用して、ウェスタンブロッティングによって、hCFTRについて膜貫通画分をスクリーニングした。16HBE細胞からのライセートを陽性対照として使用した。図12Aは、CHO及びCOS−7細胞からのデータを提示する。
文献中にCFTR陰性として記載されるベビーハムスター腎細胞(BHK)を、CHO及びCOS−7細胞と同様にトランスフェクトし、タンパク質ライセートをウェスタンブロットによってスクリーニングした。以前に公開された報告とは対照的に、マウスモノクローナル抗CFTR抗体を使用して、CFTRの明らかな陽性シグナルを観察することができた(図12B)。ウェスタンブロット分析において使用される抗体の特異性を試験するために、Eckhardt Wolf教授(Ludwig Maximilians University、Munich)により快く提供されたCFTRノックアウトブタ(PKC)からのブタ腎細胞を、トランスフェクション実験において使用し、タンパク質ライセートをCFTR発現についてスクリーニングした。図12Bにおいて明らかであった通り、CFTRのシグナルは、PKC細胞中で検出され得なかった。しかしながら、トランスフェクションは、いくらの検出可能なhCFTR発現ももたらさなかった。トランスフェクションのための対照としてルシフェラーゼを使用して、PKC細胞は、CHOまたはCOS−7細胞と比較した場合、数倍効率が低いルシフェラーゼを発現することが分かった。トランスフェクション後、スクリーニングした細胞株のいずれにおいてもhCFTRバンドの強度における有意差が検出され得なかったため、hCFTRに対するより高い感受性及び特異性を有する他のhCFTR 抗体に関する広範なスクリーニングを実施した。
ウェスタンブロットを介する抗体スクリーニング。ProteoExtract膜貫通キット(Merck)、ならびに、異なる一次抗体(Thermo Scientific Pierce Antibodies,Rockford,IL,USAからのMA1−935、Cystic Fibrosis Consortium,University of Pennsylvania,PA,USAからのAB596、及びCystic Fibrosis Consortium,University of Pennsylvania,PA,USAからのAB570)を使用する免疫ブロッティングのために使用される膜貫通画分を使用して、ヒト気管支上皮細胞株(BEAS−2B)、ヒト胚性腎細胞株(HEK)、マウス肺、及びブタ肺から、タンパク質ライセートを調製した。データを図13の通りに要約する。
MA1−935は3つの種すべてにおいてCFTRを検出した一方で、AB596はヒト及びマウスCFTRを検出するがブタは検出せず、抗体G449はヒトCFTRのみを特異的に検出する。AB570では、マウス及びブタ試料で観察されたわずかに低い分子量のバンドが、実際にCFTRまたは非特異的産物であるかは明らかではなかった。その後の実験(データは示さず)では、MA1−935が、CFTRではないバンドを認識することが分かった。したがって、一般的に、MA1−935の結果は、他の抗体を使用して生成された確証となる結果として見なされたが、使用された唯一の抗CFTR抗体がMA1−935であった実験は、決定的とは見なされなかった。
組織試料からのhCFTRの免疫沈降(IP−hCFTR)。スクリーニングした抗体すべてがいくつかの非特異的なバンドを生み出し、hCFTRの特徴的なバンド形成パターン(Cバンドは完全グリコシル化タンパク質を表し、Bバンドはコアマンノシル化形態を表す)を生み出したものはなかったことを所与として、検出の感受性及び特異性を上昇させ、それによってシグナル対ノイズ比を増加させるように、hCFTRの免疫沈降(IP)及びウェスタンブロットによるその後の検出を確立した。
van Barneveld et al.2012,Immunochemical analysis of Mutant CFTR in Lung explants,Cell Physiol.Biochem.30,587−595(2012))によって公開されたプロトコル及び抗体を使用して、Burkhard Tummler教授(Medizinsche Hochschule Hannover)と共同で、初期IP実験を実施した。hCFTRを過剰発現させるヒト結腸癌細胞(T84)を、IP実験のための陽性対照として使用した。
3つの異なる抗体(R29、R66/17、及びR66/16)を使用するhCFTRの免疫沈降と、その後のAB596を用いた免疫検出は、以下の実施例8に記載の、hCFTR SNIM RNAのエアロゾルで処置されたブタの肺からのタンパク質ライセート中のhCFTRの特異的検出をもたらした(図14)。
HGT5001製剤。HGT5001:DOPE;Chol;PEGDMG2K(相対量50:25:20:5(mg:mg:mg:mg))の製剤(「HGT5001製剤」)中のhCFTR SNIM RNAを使用するエアロゾル実験をマウスにおいて実施し、mRNA送達の24時間後における単離された肺からのタンパク質ライセートも、ブタライセートと同じ抗体及び条件を使用するIPによって分析した。しかしながら、マウス試料では、特徴的な成熟型CFTRバンド形成パターンは検出され得なかった(図15)。
インビトロでトランスフェクトされた細胞からのhCFTRの免疫沈降(IP−hCFTR)。ブタからの組織材料を使用する初期IP結果は、インビボの転写物送達後のhCFTR検出の技術的な実行可能性についての証拠を提供した。しかしながら、CFTRを免疫沈降するに当たって使用された抗体のすべて(R29、R66/17、及びR66/16)が市販されていないため、他の市販の抗体を、IP反応におけるそれらの有効性についてスクリーニングした。R&D systemsからの2つの抗体(MAB25031及びMAB1660)を試験した。
タンパク質ライセートをT84細胞から調製し、異なる濃度のMAB25031抗体を使用するIP反応において500μgの総タンパク質を使用した。次に、免疫沈降されたhCFTRタンパク質の量を、AB570(Cystic Fibrosis Foundation)を使用する免疫ブロッティングによって検出した。これらの条件下のAB596は、はるかに高いバックグラウンドをもたらしたため、さらに試験しなかった。図16Aで明らかになる通り、IP抗体の濃度が2μg/mlから4μg/mlに増加したとき、沈降されるCFTRタンパク質の量にさらなる増加はなかった。完全にグリコシル化した形態及びコアのみグリコシル化した形態の両方(それぞれCバンド及びBバンド)が検出された。ウェスタンブロットにおける一次抗体としてMAB1660を使用して、同じ免疫沈降物をスクリーニングした。しかしながら、この抗体では、バンドCのみが目に見えた(図16B)。
MAB25031抗体を使用するT84免疫沈降物からの内在性hCFTRの成功裏の検出後、トランスフェクション後のhCFTRタンパク質を検出する目的で、NIH3T3細胞における実験を実施した。NIH3T3細胞に、hCFTR SNIM RNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後においてタンパク質ライセートを調製し、BCA法を使用してタンパク質量を定量した。2μg/mlのMAB25031抗体を使用して、500μgの総タンパク質ライセートからヒトCFTRタンパク質を免疫沈降し、続いてAB570を使用する免疫ブロッティングを行った(図17)。しかしながら、CFTRは検出され得なかった。mRNAをコードするLacZをトランスフェクトされた細胞を、CFTRタンパク質の量に対するトランスフェクション自体の影響について、対照試料として分析した。
免疫沈降において使用される総タンパク質の量の500μgから8mgへの増加は、AB570を用いた免疫検出後に検出可能な一切のhCFTRタンパク質をもたらさなかった。別のhCFTR特異的抗体、MAB1660(R&D Systems)も、免疫沈降についてスクリーニングした(図18)。しかしながら、この抗体は、MAB25031ほど有効にCFTRを沈降しない。したがって、今後すべての免疫沈降を、MAB25031を用いて実施した。
ルシフェラーゼをマーカー遺伝子として使用する動力学実験が、mRNAの最大発現はトランスフェクションの24時間後において観察されることを示したため、mRNAトランスフェクト試料中のhCFTR検出の欠如は、試験したmRNAの機能性の欠如を必ずしも意味しない場合がある。hCFTR検出の欠如はむしろ、試験した試料中の不十分なhCFTR濃度、または適用された抗体の特異性の欠如に起因するものである。
PEI製剤。以下の通り調製された25kDaの分岐状PEIを有するナノ粒子製剤(「PEI製剤」)の、ブタへのhCFTR SNIM RNAの送達(実施例7を参照されたい)後にhCFTRを検出するそれらの実行可能性について、確立された条件を試験した。注射用水(Braun,Melsungen)中の適用のすぐ前に、必要量のSNIM RNAを4mlの総容積まで希釈し、10のN/P比でピペットを使用して、分岐状PEI(25kDa)の4mlの水溶液に素早く添加した。この溶液を、上下に10回ピペッティングすることによって混合し、2つの別々の4.0mlの画分として、指示された噴霧器を使用して相次いでブタ肺に噴霧した。ブタ1番のルシフェラーゼを発現する肺領域からの1つの試料、及び、ルシフェラーゼ活性が検出され得ず、したがってmRNA送達及び/または発現の欠如を示す、ブタ2番の尾状葉からの別の試料を、陽性対照及び陰性対照として選択した。これらの試料から調製されたタンパク質ライセートを、MAB25031(R&D Systems)を使用して免疫沈降し、AB570を使用してhCFTRタンパク質を検出した。図19に示す通り、ルシフェラーゼ発現は、hCFTR mRNAの発現と相関性があった。ルシフェラーゼ活性が検出不可能であったブタ2番の左尾状葉からの試料は、hCFTRについても陰性であった(レーン1)が、ルシフェラーゼに対して陽性であったブタ1番からの試料では、hCFTRは検出され得た(レーン2)。
実施例7:mRNAのエアロゾル送達
ブタの肺への被包されたmRNAエアロゾルの送達の確立。ブタ肺へのホタルルシフェラーゼ(FFL)SNIM RNAのエアロゾル投与を、段階的な実験手順によって確立した。第1のステップでは、制御呼吸の間に麻酔されたブタにFFL SNIM RNA製剤を噴霧した。第2のステップでは、エアロゾル投与が完了した直後に肺を切除し、肺検体を細胞培養培地中で一晩インキュベートし、その後BLIによって肺検体にエクスビボのルシフェラーゼ測定を実施した。
German Landraceのブタを、Technical University Munich,Weihenstephan,Germanyから取得した。ブタは35〜90kgの範囲の体重を有した。1頭のブタに各処置を実施した。合計5頭のブタを処置した。第1のブタ(体重90kg)を、EFlowメッシュ噴霧器及び肺ホモジネート中のルシフェラーゼ活性の測定を使用して、実施例6のPEI製剤中のFFL SNIM RNAで処置した。第2のブタ(体重60kg)を、EFlowメッシュ噴霧器及びBLIによる肺検体中のルシフェラーゼ活性の測定を使用して、実施例6のPEI製剤中のFFL SNIM RNAで処置した。第3のブタ(体重80kg)を、PARI BOYジェット噴霧器及びBLIによる肺検体中のルシフェラーゼ活性の測定を使用して、実施例6のPEI製剤中のFFL SNIM RNAで処置した。第4のブタ(体重60kg)を、Aeronebメッシュ噴霧器及びBLIによる肺検体中のルシフェラーゼ活性の測定を使用して、実施例6のPEI製剤中のFFL SNIM RNA/hCFTR mRNAで処置した。第5のブタ(体重35kg)を、Aeronebメッシュ噴霧器及びBLIによる肺検体中のルシフェラーゼ活性の測定を使用して、実施例6のHGT5001製剤中のFFL SNIM RNAで処置した。
アザペロン2mg/体重kg、ケタミン15mg/体重kg、アトロピン0.1mg/体重kgの前投薬、続いて外側耳介静脈への静脈ラインの挿入によって、ブタの鎮静を開始した。必要に応じてプロポフォール3〜5mg/体重kgの静脈内注射によって、ブタを麻酔した。必要に応じて麻酔を強化するために、4〜8mg/体重kgのイソフルラン(2〜3%)と1%のプロポフォールのボーラス注入によって麻酔を維持した。麻酔の持続時間はおよそ1〜3時間であった。外側耳静脈を介するペントバルビタール(100mg/体重kg)及び塩化カリウムのボーラス注入でブタを殺処理した。肺を切除し、組織検体を様々な肺領域から採取し、続いて細胞培養培地中で一晩インキュベートした。ルシフェラーゼ活性の測定のため、組織検体を、管用ルミノメーター内でホモジナイズして分析するか、またはD−ルシフェリン基質を含む培地浴中でインキュベートし、エクスビボルシフェラーゼBLIを行うかのいずれかを行った。
ブタ1番の詳細及び結果。実験の設定を図20に示す。エアロゾル投与のために、EFlowメッシュ噴霧器を人工呼吸器の換気管にインライン接続した。エアロゾル投与はおよそ60分かかり、開放系を用いた対照実験から予想されるよりも長かった。これは明らかに、メッシュ噴霧器のリザーバにおけるエアロゾルの流出によって証明される通り、噴霧の間の増加した背圧によって引き起こされた。注射用水中に1mgのFFL SNIM RNAを含む8ミリリットルの実施例6のPEI製剤を、WP5に記載の通り調製し、2回に分けて4mlずつの分量で相次いで噴霧した。細胞培養培地における一晩のインキュベーション後、様々な肺領域の切除された肺検体の組織ホモジネート中で、ルシフェラーゼ測定を実施した。肺検体の起点に従って、発現値をマッピングした(図21)。
結果は、ブタ肺組織中の成功裏のルシフェラーゼ発現を示した。ルシフェラーゼ発現は肺の中央部分で最も高く、肺のより遠位の領域に向かって減少した。この発現パターンは、選択された換気パラメータに従って、吸入されたFFL SNIM RNA−PEIナノ粒子の予想される堆積パターンと相関性があった。ルシフェラーゼ発現のレベルは、同じ実施例6のPEI製剤を使用するWP5におけるマウス実験で観察されたものと同じ範囲内であった。
ブタ2番の詳細及び結果。ブタ2番における実施例6のPEI製剤中のFFL SNIM RNAのエアロゾル投与を、ブタ1番と同様に実施したが、ルシフェラーゼ活性は、生物発光造影(BLI)によって、肺検体で測定した。この実験を実施して、BLIによる器官培養肺検体のエクスビボのルシフェラーゼ測定を確立した。ルシフェラーゼ測定は、処置されたブタの異なる肺領域の個別の組織検体中で明らかに観察された(図22)。この実験は、ブタ1番から得られた結果を確証した。
ブタ3番の詳細及び結果。EFlowメッシュ噴霧器を使用するブタ1番及び2番におけるエアロゾル投与は、いくつかの技術的難点及び不十分な噴霧時間を明らかにした。したがって、Tコネクタを介して換気管に接続されたPARI BOYジェット噴霧器を使用して、ブタ3番を処置した。エアロゾル投与は、EFlowメッシュ噴霧器を用いるよりも長く(およそ80分間)持続し、エアロゾル投与は満足のいくものではなかった。非常に低いルシフェラーゼ活性が、処置されたブタの異なる肺領域からスライスした肺試料中で検出された(図23)。
ブタ4番の詳細及び結果。以前の実験の結果は、メッシュ噴霧器が、ジェット噴霧器よりも、選択された設定におけるブタの肺へのエアロゾル投与に好適であることを実証した。この理由のため、別のメッシュ噴霧器をこの目的のために試験し、これは、開放系で試験した際に実施例6のPEI製剤を満足に噴霧した。人工呼吸器の管にインライン接続されたAeronebメッシュ噴霧器を使用して、ブタ4番を処置した。この実験では、1mgのhCFTR mRNAを、実施例6のPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNAとともに共送達した。これは、実施例8で実施する繰り返しの投薬に関して、共製剤化された(co−formulated)FFL SNIM RNA/hCFTR mRNA−PEIナノ粒子の製剤安定性及び噴霧可能性(nebulisability)を試験するために行った。この製剤は安定しており、噴霧との不適合性を露呈しなかった。ルシフェラーゼ活性は、処置されたブタの異なる肺領域の個別の組織検体中で明らかに観察された(図24)。
この実験は、ブタ1番及びブタ2番から得られた結果を確証したが、より高い発現レベルが得られた。この実験は、Aeronebメッシュ噴霧器が、ブタの肺への実施例6のPEI製剤の送達に最適であったことを示した。さらに、この実験は、hCFTR mRNAとともに共送達されたときにFFL SNIM RNAが依然として活性であったことを実証した。
ブタ5番の詳細及び結果。ブタ5番を、Aeronebメッシュ噴霧器を用いてエアロゾル化された実施例6のHGT5001製剤中1mgのFFL SNIM RNAで処置した。製剤は、技術的難点なしにエアロゾル化され得た。ルシフェラーゼ活性は、処置されたブタの異なる肺領域の個別の組織検体中で明らかに観察された(図25)。
この実験は、発現レベルは実施例6のPEI製剤で処置されたブタにおけるものよりもおよそ15〜20分の1まで低かったが、実施例6のHGT5001製剤中のエアロゾル化されたFFL SNIM RNAが、ブタ肺組織中で活性であることを示した。
結論。成功裏の結果が、実施例6のPEI製剤を用いたAeronebメッシュ噴霧器を使用して得られた。4頭のブタを実施例6のPEI製剤で処置し、エアロゾル送達のための最適な実験設定を特定した。結果は、ルシフェラーゼ発現が、ブタ肺ホモジネートにおいて、そしてBLIによって検出され得たことを実証した。ルシフェラーゼ発現は肺の中央部分で最も高く、肺の遠位領域ではほとんど見られなかった。Aeronebメッシュ噴霧器は、最短の送達時間とともに最良の結果をもたらすことが分かった。これらの実験に従って、別のブタを、実施例6のHGT5001製剤中に被包されたFFL SNIM RNAで処置した。ルシフェラーゼ発現はブタ肺のいくつかの部分で明らかに観察されたが、発現レベルは実施例6のPEI製剤中のFFL SNIM RNAについてのものよりも低かった。このワークパッケージの結果は、大型の前臨床動物モデルとしてのブタの肺へのSNIM RNA送達が、ポリマー(例えば、PEI)ベースの製剤及び脂質(例えば、HGT5001)ベースの製剤などの様々な製剤を使用して実行可能であったことを明らかに実証した。この実施例の結果は、ヒト患者における状況を綿密に模倣する大型動物の肺への、臨床実践で使用される噴霧器による成功裏のSNIM RNA送達についての概念の証拠を提供した。
実施例8:インビボのmRNA送達(週用量)
治験を実施し、ブタにおける週1回のエアロゾル適用の実用性を評価した。肺疾患の誘導を伴わず(等級2より高い有害事象の存在なし)に1週間の間隔で修飾mRNAの3回のエアロゾル適用を実施することとして、実用性を定義した。追加の目的は、i)動物の苦痛の等級、ii)ブタの実験的または臨床的査定の間に生じる有害事象、ならびにiii)誘導されるタンパク質(ルシフェラーゼ及びhCFTR)の測定を評価するためであった。
ブタの肺へのPEI製剤中のSNIM RNAの繰り返しのエアロゾル投与を確立した。2頭のブタの群を、実施例6のPEI製剤中のFFL SNIM RNA/hCFTR SNIM RNAを用いて、弱く間隔で1回、2回、または3回処置した。2頭の無処置ブタを対照とした。処置の24時間後に肺を切除し、BLIによって単離された肺検体中のエクスビボのルシフェラーゼ活性を測定した。IP/WBを使用してhCFTRタンパク質の発現を分析した。細胞レベルでのルシフェラーゼ発現の検出のため、免疫組織化学的検査(IHC)を実施した。血清中の炎症性サイトカイン及び血液化学の測定によって、毒性を調査した。肺試料に病理組織診断を実施した。研究プロトコル「パイロットプロジェクト:ブタにおける嚢胞性線維症のエアロゾル療法のための動物モデルを確立するための修飾mRNAの繰り返しの適用(Pilot project: Repeated application of modified mRNA to establish an animal model for aerosol therapy of cystic fibrosis in pigs)」は、実験の開始前に地方当局によって承認された(動物実験許諾番号0−045−12)。
実験設計。雌で噴霧時におよそ6週齢(平均体重約25kg)のブタ、German Landraceを、Technical University Munich,Weihenstephan,Germanyから購入した。ブタをランダム化し、以下のスキーム(表3)に従って処置した。各2頭のブタの処置群は以下の通りであった。
0群−処置なしの対照群
I群−1日目に実施例6のPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA及び1mgのhCFTR SNIM RNAのエアロゾル投与。
II群−1日目に実施例6のPEI製剤中の2mgのhCFTR SNIM RNAのエアロゾル投与、かつ8日目に実施例6のPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA及び1mgのhCFTR SNIM RNAのエアロゾル投与。
III群−1日目及び8日目に実施例6のPEI製剤中の2mgのhCFTR SNIM RNA(6379−186)のエアロゾル投与、15日目に実施例6のPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA及び1mgのhCFTR SNIM RNAのエアロゾル投与。
処置のためのスキーム及び各群の評価を表3に示す。例示される治療介入に加えて、ブタの身体検査を日常的に行った。

実験手順。アザペロン2mg/体重kg、ケタミン15mg/体重kg、アトロピン0.1mg/体重kgの前投薬、続いて外側耳介静脈への静脈ラインの挿入によって、ブタの鎮静を開始した。必要に応じてプロポフォール3〜5mg/体重kgの静脈内注射によって、ブタを麻酔した。必要に応じて1%のプロポフォールの連続的な静脈内注入で麻酔を維持した。換気パラメータを呼気終末二酸化炭素と一致させ、必要に応じて調整した。パルスオキシメトリ、カプノグラフィ、直腸温プローブ、及び反射状態を使用して、麻酔、呼吸、及び心血管のパラメータを連続的に監視した。動物は、10ml/kg/時で平衡電解液の注入を受けた。麻酔の持続時間はおよそ80〜120分間であった。十分な自発呼吸の開始後に、ブタを抜管した。鎮静後、外側耳静脈を介する100mg/体重kgのペントバルビタールのボーラス注入でブタを殺処理した。肺を切除し、スライスされたおよそ1cm厚の組織検体を様々な肺領域から採取し、続いて細胞培養液中でのインキュベーションを行った。ルシフェラーゼ活性の測定のため、組織検体を、D−ルシフェリン基質を含む培地浴中でインキュベートし、エクスビボのルシフェラーゼBLIを行った。
BLIによる処置群におけるルシフェラーゼ発現。
0群(処置なしの対照群)については、ルシフェラーゼ活性は、肺スライスにおいて観察されなかった(図26)。
I群(実施例6のPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA及び1mgのhCFTR SNIM RNAのエアロゾル投与)については、ルシフェラーゼ活性は、1回処置されたブタ3番及び6番の肺検体中で明らかに検出された(図27)。ルシフェラーゼ発現は、肺の中央部分で最も高かった。
II群(1日目に実施例6のPEI製剤中の2mgのhCFTR SNIM RNAのエアロゾル投与、かつ8日目に実施例6のPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA及び1mgのhCFTR SNIM RNAのエアロゾル投与)については、ルシフェラーゼ活性は、2回処置されたブタ4番及び8番の肺検体中で明らかに検出された(図28)。ルシフェラーゼ発現は、肺の中央部分で最も高かった。測定日の停電及びBLIシステムに結果として生じた技術的問題のため、試料を測定前に細胞培養培地中でさらに10時間保管したことを考慮すべきである。
III群(1日目及び8日目に実施例6のPEI製剤中の2mgのhCFTR SNIM RNAのエアロゾル投与、15日目に実施例6のPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA及び1mgのhCFTR SNIM RNAのエアロゾル投与)については、ルシフェラーゼ活性は、3回処置されたブタ1番及び2番の肺検体中で明らかに検出された(図29)。ルシフェラーゼ発現は、肺の中央部分で最も高かった。
SNIM RNA−PEIナノ粒子の特性。噴霧前に、SNIM RNA−PEI製剤の粒径及びゼータ電位を測定した(表X1)。SNIM RNA−PEIナノ粒子は、25〜37nmの範囲の粒径及び30〜49mVの範囲のゼータ電位をもって再現性よく形成され得る。

IHCによる処置群におけるルシフェラーゼ発現。BLIにより陽性であった肺スライス(Sophistolab AG,Eglisau,Switzerland)の組織検体にFFLのためのIHCを実施し、無処置ブタの肺組織及び陽性対照としてのルシフェラーゼ陽性マウス腫瘍組織と比較した。予想された通り、強いシグナルがルシフェラーゼ陽性マウス腫瘍組織中に見られたが、無処置ブタの肺組織は特異的染色を示さなかった。明らかに検出可能な染色パターンが、3回の処置を受けたブタ1番の肺組織中で観察され得た。FFL発現は、大小の気道の気管支上皮中で最も顕著であった(図30)。
IP/WBによる処置されたブタの肺組織中のhCFTRタンパク質の検出。3回処置されたブタ1番の高度にBLI陽性の肺組織に、van Barneveld A et al.,Cell Physiol Biochem.30,587−95(2012)によって説明されるプロトコルに従って、hCFTRのIP/WBを行った(図31)。成熟型複合グリコシル化hCFTRが、分散したいわゆるCバンドとして現れる。マンノースが豊富なhCFTRが、より高密度ないわゆるBバンドとして現れる。明らかに、hCFTR発現が、T84陽性対照細胞、及び実施例6のPEI製剤中のhCFTR SNIM RNAで処置されたブタ1番の肺組織中で観察される。hCFTRタンパク質の発現は、無処置ブタでは観察されなかった。同一のプロトコル(van Barneveld Aら、上記参照)を使用する公開された研究によるヒト肺組織中のhCFTRタンパク質発現の比較は、hCFTR SNIMエアロゾル処置後のブタ肺組織中のhCFTRの発現が、健常なヒトの肺におけるhCFTR発現と同様であったことを示唆した。
この所見は、処置されたブタの肺におけるIP/WBによるhCFTRタンパク質の検出のために異なる組の抗体を使用することによって、さらに確証された(実施例6を参照されたい)。ブタ1番のルシフェラーゼを発現する肺領域からの1つの試料、及び、ルシフェラーゼ活性が検出され得ず、したがってmRNA送達及び/または発現の欠如を示す、ブタ2番の尾状葉からの別の試料を、陽性対照及び陰性対照として選択した。これらの試料から調製されたタンパク質ライセートを、MAB25031(R&D Systems)を使用して免疫沈降し、AB570を使用してhCFTRタンパク質を検出した。図32に示す通り、ルシフェラーゼ発現は、hCFTR mRNAの発現と相関性があった。ルシフェラーゼ活性が検出不可能であったブタ2番の左尾状葉からの試料は、hCFTRについても陰性であった(レーン1)が、ルシフェラーゼに対して陽性であったブタ1番からの試料では、hCFTRは検出され得た(レーン2)。
毒性:肺試料の予備的組織学的査定。3頭の動物の安楽死後に取った肺の試料の組織学的査定を実施した。パラフィン切片に包埋した後、形態学的評価のために肺試料をHematoxiline−Eosineで染色した。所見は3頭のブタの試料全体で一貫しており、これらのうち2つ(ブタ1番及びブタ2番)は、3回のエアロゾル適用を受け、第3(ブタ7番)はエアロゾル適用なしの無処置対照であった。
毒性:苦痛。ブタ2番及びブタ1番のみ、第1の処置後2〜4日目に苦痛の軽度の兆候を示した。したがって、3週間以内の3回のエアロゾル適用は、軽度の苦痛しか引き起こさなかった。
毒性:有害事象。有害事象(AE)の種類及び頻度を、ブタの検査パラメータ(血液、MBS、及びBAL)ならびに身体検査(この治験では二次的目的として定義される)によって分析した。
研究プロトコルによって定義される時間点において、血清及び全血試料を取った。器官特異性病理(血液、骨髄、肝臓、筋肉、及び腎臓)を示すことを示唆する12の代表的なパラメータ(ヘモグロビン、ヘマトクリット、AP、ALT、AST、CK、ビリルビン、クレアチニン、グルコース、カリウム、血小板、及び白血球細胞)を選択し、VetMedLab,Ludwigsburg,Germanyから得た試験結果をVCOG、バージョン2011に従って分類した。
結果は、重度の有害事象(AE)がブタにおいて観察されなかったことを示した(等級3、4、または5のAEが重度と見なされたであろう)。実施例6のPEI製剤中のSNIM RNAのエアロゾル適用後に検査パラメータの障害はなかった。いくつかのパラメータ(例えば、CKまたは肝臓酵素)のわずかな変化については、これらの変化は、むしろ実験手順自体(例えば、筋肉内注射及び麻酔)によって引き起こされた可能性が高い。また、繰り返しの適用からの陰性の効果は検出され得なかった(第3の適用後であっても、3群のブタはAE等級2よりも高いAEを示さない)。AE等級1または2でさえ稀であり、実施例6のPEI製剤中のSNIM RNAのエアロゾル適用との相関性を示さなかった。
繰り返しの血液試料の他に、2つの他のパラメータを査定し、肺における病理学的過程:i)安楽死後に取られる気管支肺胞洗浄液(BALF)、及びii)微生物試料(MBS)(麻酔の間に取られるスメア形態気管)を評価した。剖検の間に各ブタからBALFを取り、さらなる検査のために−80℃で保管した。各エアロゾル適用前に気管のスメアを取り、微生物学的に検査した。これらの検査は、ボルデテラ‐ブロンキオスペクチカ(Bordetella bronchiospectica)(ブタの呼吸器の一般的な病原体)及び大腸菌を含む、病原体の広範なスペクトルを明らかにした。ブタを、ツラスロマイシンの筋肉内注射(1mlのDraxxin(登録商標)10%)で1回処置した。
身体検査。検査パラメータに加えて、エアロゾル適用の間の観察期間中にブタの身体検査を実施した(詳細は研究プロトコルの附属書類1の1.1.2及び附属書類4を参照されたい)。AEの記述、等級分け、及び属性の割り当てのためのシステムは、ブタに関しては治療介入またはその他のいずれについても定義されていないため、イヌ及びネコのために確立された一般的な毒性基準(CTC)システム(VOCGによって2011年に公開された)を使用した。検査パラメータを等級分けするために、種特異性ULN(正常上限)及びLLN(正常下限)を使用した。以下の6つのAE分類内で臨床的査定を行った:
(1)アレルギー性/免疫性事象、(2)肺性/呼吸性、(3)体質的臨床兆候、(4)皮膚科学的/皮膚、(5)胃腸管系、及び(6)肺性/呼吸性。
結果は、ブタにおいて重度のAEが観察されなかった(等級3、4、または5がない)ことを示した。PEI製剤中のSNIMRNAのエアロゾル適用後に身体検査によって査定されたパラメータの障害はなかった。3群の2頭のブタは、呼吸パラメータのうちの3つにおいて等級1及び2のAE(気管支痙攣/喘鳴、喉頭水腫、及び呼吸困難)を示したが、これらの軽度または中等度の所見は、1日もしくは2日に制限された。これらの観察は、これら2頭のブタにおいて第1の麻酔/挿管/エアロゾル適用の後のみに生じたが、これら2頭のブタもしくはいずれの他のブタにおいても、第2または第3のエアロゾル適用後には生じなかったため、これらの所見が調査中の物質によって引き起こされることはありそうにない。
結論。この実施例の結果は、FFL及びhCFTR SNIM RNAをコードするPEI製剤が、各処置サイクル後の活性の損失なしに、かつ有害事象なしに、ブタの肺に繰り返し成功裏にエアロゾル化され得ることを実証した。ルシフェラーゼ発現は肺組織の中央部分に見られたが、遠位の肺領域ではほとんど検出されなかった。ルシフェラーゼ発現の領域パターンは、制御呼吸のために使用される設定に従って、実施例6のPEI製剤の予想される堆積パターンと相関性があった。選択された肺試料形態処置されたブタへの免疫組織化学的検査は、主に大小の気道の気管支上皮中のルシフェラーゼ発現を示した。IP/WBは、無処置ブタの肺及びルシフェラーゼ陰性肺検体では不在であった、処置されたブタの肺における成熟型ヒトCFTRの複合グリコシル化Cバンドの発現を明らかに実証した。hCFTRタンパク質検出のための同一のプロトコルを使用する公開された報告と比較した場合、hCFTR SNIM RNAエアロゾル処置後のブタ肺組織中のhCFTRの発現は、健常なヒトの肺におけるhCFTR発現に匹敵した。有害事象の等級1または2は非常に稀であり、PEI製剤中のSNIMRNAのエアロゾル適用との相関性を示さなかった。したがって、hCFTRタンパク質の発現は、SNIMhCFTR mRNAで処置されたブタの肺において成功裏に実証された。
実施例9:シグナルペプチドを含有するCFTRをコードするmRNA
この実施例は、CFTRタンパク質が、シグナルペプチドをコードする配列を有するCFTRをコードするmRNAから有効に発現され得ることを実証する。
伝令RNA合成。実験のため、C末端His10タグ付きコドン最適化ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CO−CFTR−C−His10)(配列番号15)、成長ホルモンシグナル配列リーダーを有するコドン最適化ヒトCFTR(GH−CO−CFTR)(配列番号16)、及びコドン最適化ヒトCFTR(CO−CFTR)(配列番号17)SNIM RNAを、標準的な方法を使用してプラスミドDNA鋳型からインビトロ転写によって合成した。細胞及びCFTRトランスフェクション。ヒト胎児腎臓HEK293T細胞を、10%のウシ胎仔血清、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン、及び100μg/mlのストレプトマイシンを追加したDMEM(Invitrogenカタログ番号11965−092)内で成長させた。トランスフェクションの前日に、50〜60%コンフルエンスの6ウェルプレートに細胞をプレーティングし、正常組織培養条件下(5%のCO2、95%の空気の加湿雰囲気中で36℃)でインキュベートした。トランスフェクションのための調製において、60μlのLipofectamine 2000(Invitrogenカタログ番号11668019)を、OptiMem低血清培地(Invitrogenカタログ番号31985−062)中で希釈し、穏やかにボルテックスした。実験のため、4μgのCO−CFTR、GH−CO−CFTR、またはCO−CFTR−C−His10 SNIM RNAのいずれかを、900μlのOptiMem培地中で希釈した。このmRNAを、希釈したLipofectamine(登録商標)に直ちに添加し、室温で30分間インキュベートした。プレーティング培地を、穏やかに吸引し、1mlのOptiMem低血清培地及び300μlの各mRNA/Lipofectamine(登録商標)複合体のそれぞれと交換した。細胞を標準的な組織培養条件下でインキュベートした。
ウェスタン分析。およそ48のトランスフェクション後、細胞をそれぞれのプレートから除去し、溶解させた。全細胞ライセートに、SDS−PAGEによる分離を行い、ウェスタンブロットによってプローブした。図33に示す通り、CO−CFTR、GH−CO−CFTR、及びヒトCO−CFTR−C−His10mRNAのトランスフェクション後、抗CFTR(A&B)または抗His(C)抗体によって、ヒトCFTRタンパク質の強い発現が検出された(図33)。
実施例10:CFTRノックアウトマウスへのインビボのCO−CFTR−C−His10 mRNAの送達
気管内投与されたmRNAが充填されたナノ粒子を介して産生されたヒトCFTRタンパク質の分析。CFTR KOマウスを使用して、すべての研究を実施した。PARI Boyジェット噴霧器を使用して、CFTR mRNA製剤またはビヒクル対照を導入した。マウスを屠殺し、所定期間後、mRNAからのタンパク質発現を可能にするため、生理食塩水で灌流した。
伝令RNA合成。この実施例では、C末端His10タグ付きコドン最適化ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CO−CFTR−C−His10)SNIM RNA、及びコドン最適化FFL SNIM RNAを、プラスミドDNA鋳型からインビトロ転写によって合成した。
PEI製剤。この手法では、CFTR ノックアウトマウスの肺におけるCO−CFTR−C−His10 mRNAの送達及び発現を、ポリマー及び脂質ベースのナノ粒子製剤の両方を使用して評価した。以下の通り調製した25kDaの分岐状PEIを有するポリマーナノ粒子製剤。注射用水(Braun,Melsungen)中の適用のすぐ前に、必要量のSNIM RNAを4mlの総容積まで希釈し、10のN/P比でピペットを使用して、分岐状PEI(25kDa)の4mlの水溶液に素早く添加した。この溶液を、上下に10回ピペッティングすることによって混合し、2つの別々の4.0mlの画分として、指示された噴霧器を使用して相次いでマウス肺に噴霧した。
cKK−E12製剤。脂質ベースのナノ粒子の実験のために、cKK−E12:DOPE:Chol:PEGDMG2K(相対量50:25:20:5(mg:mg:mg:mg)の製剤中のCO−CFTR−C−His10 SNIM RNAを使用して、脂質製剤を生成した。この溶液を、指示された噴霧器を使用してマウス肺に噴霧した。
ヒトCO−CFTR−C−His10 mRNAの噴霧(エアロゾル)投与。CFTR試験材料を、PARI Boyジェット噴霧器を介する単一のエアロゾル吸入によって投与した(最大8mL/群の名目用量容積)。試験材料を、動物の全群を収容するボックス(n=4)に送達し、酸素流及び捕捉システムに接続した。
ヒトCO−CFTR−C−His10 mRNAの投与。上記の方法でCFTR mRNAを調製した。4匹のCFTR ノックアウトマウスをエアロゾルチャンバボックスに配置し、およそ1時間にわたる噴霧(Pari Boyジェット噴霧器)を介して、2mgの全コドンを最適化した無修飾ヒトCFTR mRNA(配列番号3のコード配列を含む)に曝露した。曝露の24時間後にマウスを屠殺した。
安楽死。動物を、用量投与(±5%)後の代表的な時間にCO2窒息によって安楽死させ、続いて開胸及び全採血を行った。心穿刺を介して全血(最大の入手可能な容積)を採取し、廃棄した。
灌流。全採血後、全動物は、生理食塩水を用いた心臓灌流を受けた。手短に言えば、灌流のために左心室の管腔内に置かれた生理食塩水を含む10mLのシリンジに取付けられた23/21ゲージの針を挿入することによって、全身の心臓内灌流を実施した。右心房を切開し、灌流液の排液口を提供した。穏やかで安定した圧力をプランジャーに適用し、針を心臓内に配置した後、動物を灌流した。フラッシング溶液が身体を飽和し、手順が完了したことを示すように、出てくる灌流液が澄んで(目に見える血液がなく)流れるとき、十分な流量のフラッシング溶液を確保した。
組織採取。灌流後、全動物の肺(右及び左)を収集した。両方(右及び左)の肺を液体窒素中で即座に凍結し、名目上−70℃で別々に保管した。
CFTRノックアウトマウスにおけるCO−CFTR−C−His10 mRNAからのヒトCFTRの発現。CFTR mRNA処置マウス肺から採取した組織ライセートのウェスタンブロット分析によって、CFTR発現を検出した。脂質ベース及びポリマーベースの製剤の両方について、成熟型「C」バンドは、すべての処置マウスの左及び右の肺において検出された(図34)。実施例9に記載の、HEK 293TヒトCO−CFTR−C−His10陽性細胞から採取したライセートとの比較によって、成熟型「C」バンドの発現を確認した。対照的に、検出可能なシグナルは、野生型の無処置対照マウスから採取したライセート中で観察されなかった(図34)。まとめると、これらのデータは、ポリマー及び脂質ベースの製剤(例えば上記のcKK−E12製剤など)の両方が、例えば、吸入を介するCFTR mRNAの肺送達に有効であり、かつ、一度送達されると、コドン最適化CFTR mRNAが、ヒトCFTRタンパク質を有効に発現し得ることを示唆する。
実施例11:インビボの用量増大研究
ブタの肺へのPEIで被包されたmRNAのエアロゾル送達の用量増大。ホタルルシフェラーゼ(FFL)SNIM RNAと、コドン最適化ヒトCFTR(CO−CFTR)SNIM RNAとの組み合わせの、様々な濃度でのブタ肺へのエアロゾル投与を、段階的な実験手順によって確立した。第1のステップでは、制御呼吸の間に麻酔されたブタにFFL/CO−CFTR SNIM RNA製剤を噴霧した。第2のステップでは、エアロゾル投与が完了した24時間後の鎮静後に、外側耳静脈を介するペントバルビタール(100mg/体重kg)及び塩化カリウムのボーラス注入によって、動物を屠殺した。肺を切除し、およそ1cm厚の組織検体にスライスした。ルシフェラーゼ活性の測定のため、組織検体を、D−ルシフェリン基質を含む培地浴中でインキュベートし、エクスビボのルシフェラーゼBLIを行った。BLIの後、病理組織診断、免疫組織化学的検査、ならびにインサイツのハイブリダイゼーションのために、ルシフェラーゼ陽性領域及びルシフェラーゼ陰性領域からの試料を取った。残留する検体を液体窒素中でショック凍結し、その後、IP/WB及び酵素結合免疫吸着検定法による分析まで−80℃で保管した。
伝令RNA合成。この実施例では、コドン最適化ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CO−CFTR)SNIM RNA、コドン最適化FFL mRNA SNIM RNAを、標準的な方法を使用してプラスミドDNA鋳型からインビトロ転写によって合成した。
実験設計。German Landraceのブタを、Technical University Munich,Weihenstephan,Germanyから取得した。ブタは35〜90kgの範囲の体重を有した。可変性を制御するために、年齢及び体重をマッチさせたブタの両方を使用して、この研究を設計した。4アーム研究の各実験群について、6頭のブタ(雄3頭及び雌3頭)の単一のコホートを確立した。第1のコホートを、Aeronebメッシュ噴霧器を使用して投与された注射用水(WFI)単独で処置した。第2のコホートを、Aeronebメッシュ噴霧器を使用して、以下に記載のPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA及び1mgのコドン最適化ヒトCFTR(CO−CFTR)SNIM RNAの溶液で処置した。第3のコホートは、以下に記載のPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA及び5mgのコドン最適化ヒトCFTR(CO−CFTR)SNIM RNAを受けた。第4のコホートを、以下に記載のPEI製剤中の1mgのFFL SNIM RNA及び10mgのコドン最適化ヒトCFTR(CO−CFTR)SNIM RNAで処置した。処置のためのスキーム及び各群の評価を以下の表4に示す。

mRNA−PEI製剤。以下に記載の例示的な標準化された製剤化手順を、動物の処置のすぐ前に実施した。

8mL:3mLの容積の注射用水及び3mLのRNA原液(c:水中1mg/mL;1.5mLのFFL mRNA+1.5mLのCFTR mRNA)中、1mgのhCFTR SNIM RNA及び1mgのFFL SNIM RNA N/P 10を含有するポリプレックスの調製のための例示的な方法を、15mLのファルコン管に充填した。第2のファルコン管において、5.61mLの注射用水を0.39mLのbrPEI原液(c:水中10mg/mL)と混合した。2つの20mLのシリンジを、混合装置内に固定した。それらの各々を、管を介して針に接続した。シリンジポンプの取水機能を使用して、一方のシリンジをRNA溶液で、そして他方をPEI溶液で充填した。(設定:直径:20.1mm、流速:5mL/分、容積:5.9mL)。針を除去し、管を混合弁に接続した。RNA溶液を含有するシリンジを、弁の傾斜した位置に接続することが重要であった。出口の直径を制御するため、針を接続した。シリンジポンプの注入機能を使用して混合を実施した(設定:直径:20.1mm、流速:40mL/分、容積:5.8mL)。再現可能な多分散指数を達成するため、混合の間に試料を手動で分画した。流速が安定するまで(100〜200μL)の初めの数μL、及び気泡をしばしば含有する最後の数μLを、別々の管に採取した。この混合物を、ポリプレックス形成のために室温で30分間インキュベートし、その後、氷上で保管した。異なる用量のために、表5に示す通りパラメータを修正して適合させた。

噴霧される複合体の機能性を調べるためのHEK細胞のトランスフェクション。噴霧後、複合体(80μl)のアリコートを使用して、HEK細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの1日前に、1×10細胞を6ウェルプレートにプレーティングした。トランスフェクション当日、細胞から培地を除去し、細胞をPBSで1回洗浄し、その後、80μlの複合体を、920μlの血清を含まないMEM培地とともにウェル毎に添加した。各複合体について、3つの複製ウェルを調製した。この細胞を、標準的な細胞培養条件下で、複合体とともに4時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、培地を含有する複合体を除去し、MEM培地を含有する血清(1ml)をウェル毎に添加した。プレートを、標準的な細胞培養条件下でインキュベートした。トランスフェクションの24時間後に、ホモジネーションステップを除いて、動物組織のために使用したものと同じプロトコル及び緩衝液を使用して、タンパク質ライセートを調製した。3つのウェルからの細胞を、分析のために貯蔵した。R24.1抗体(R&D Systems)を用いた免疫沈降、ならびに217、432、及び596抗体(すべてCystic Fibrosis Consortium,University of Pennsylvania,PA,USAから)の組み合わせを用いたウェスタンブロットを使用して、ヒトCFTRの発現を検出した。ブタにおいて噴霧された複合体のすべてについて、hCFTRが検出され得た(図54〜57を参照されたい)。
エアロゾル適用。エアロゾル(WFI単独44ml;WFIにおける修飾mRNA PEI製剤:8、24、及び44ml)を、Aeroneb(登録商標)メッシュ噴霧器を介して、麻酔されたブタに噴霧し吸入させた。アザペロン2mg/体重kg、ケタミン15mg/体重kg、アトロピン0.1mg/体重kgの前投薬、続いて外側耳介静脈への静脈ラインの挿入によって、ブタの鎮静を開始した。必要に応じてプロポフォール3〜5mg/体重kgの静脈内注射によって、ブタを麻酔した。必要に応じて麻酔を強化するために、4〜8mg/体重kgのイソフルラン(2〜3%)と1%のプロポフォールのボーラス注入によって麻酔を維持した。麻酔の持続時間はおよそ1〜3時間であった。エアロゾル化完了の24時間後、外側耳静脈を介するペントバルビタール(100mg/体重kg)及び塩化カリウムのボーラス注入でブタを屠殺した。肺を切除し、組織検体を様々な肺領域から採取した。保管した試料に、生物発光、病理組織診断、IP/ウェスタンブロット、及び酵素結合免疫吸着検定法などの異なる査定法を行った。
生物発光分析。ルシフェラーゼ活性の測定のため、組織検体を、管用ルミノメーター内でホモジナイズして分析するか、またはD−ルシフェリン基質を含む培地浴中でインキュベートし、エクスビボルシフェラーゼBLIを行うかのいずれかを行った。データは、コホート1(WFIビヒクル対照)からの対照肺組織試料と比較した場合、コホート2〜4(それぞれ1mg、5mg、及び10mg)のそれぞれについて、強い生物発光シグナルが観察されたことを示す(図35〜38)。
ウェスタンブロット及び免疫組織化学的検査によるCFTR発現分析。FFL陽性組織試料を切除し(コホート内の各ブタにつき最低10の試料)、ヒトCFTRについて、免疫沈降/ウェスタンブロット(IP−WB)、及び免疫組織化学的検査によって分析した。手短に言えば、タンパク質ライセートを、ブタ肺から以下の通りに調製した:300〜400mgの肺組織を分析に使用した。LysingMatrixA(MPBiomedicals、参照:6910−500)及びホモジナイザー「FastPrep24」(MP Biomedicals)を使用して、プロテアーゼ阻害剤を含有する基礎緩衝液(20mMのTris、150mMのNaCl、pH8.0)中で、組織をホモジナイズした。この全組織ミックスを、新たな2mlの安全錠の予冷したEppendorf管に移動させ、25μlのヨードアセトアミド(Sigma:I6125)及び1μlのOmniクリーブ(Omniクリーブ緩衝液中で1:5に希釈)(Epicenter:OC7810K)を添加した。次にこの試料を、氷上で5分間インキュベートし、その後、26μlの10%のSDS溶液を添加した。4℃で60分間、シェーカーで試料をさらにインキュベートした。インキュベーション後、260μlの溶解緩衝液(850μlの基礎緩衝液+10%のTritonX−100+5%のデオキシコール酸ナトリウム)を試料に添加し、4℃で90分間、シェーカーでそれらをインキュベートした。最後に、タンパク質ライセートを、10〜20分間4℃で、13,000rpmにおいて遠心分離し、上清を新たなEppendorf管に移動させた。BCAタンパク質アッセイ(Pierce)を使用して、タンパク質濃度を定量した。10mgの総タンパク質を含有するように試料を等分し、基礎緩衝液を用いて最終容量を試料当たり1mlに調整した。実施例6に提示されるデータに基づいて、抗体R24.1を使用するCFTRの免疫沈降を行い、その後、Cystic Fibrosis Consortium,University of Pennsylvania,PA,USAから得た3つの異なる抗体(抗体217、432、596)の3重の組み合わせを使用するCFTRのウェスタンブロット免疫検出を行った。異なる動物間の群内の可変性、及びCFTR発現の可変性を制御するため、150kDaに対応するタンパク質の大きさの標準におけるマーカーバンドを基準として設定し、異なる群のバンド強度をこの値に正規化した。図39に示す通り、コホート1の対照ブタから分析された組織試料の16%のみが、基線を超えるCFTR発現レベルをもたらした。対照的に、それぞれ5mg及び10mgの処置群を表すコホート3及び4は、それぞれ、それらの肺組織試料の30%超が、基線よりも高いCFTR発現レベルに陽性の試験結果をもたらした(図39)。さらに、コホート3及び4において観察されたCFTR発現の増加は、対照のものよりもほぼ2倍高かった。
CFTR陽性の気管支及び細気管支の定量によって、CFTR免疫組織化学的検査の分析を実施した。少なくとも1つの上皮細胞が明らかな膜局在型CFTRシグナルを示す上皮細胞層において検出された場合、気管支/細気管支を陽性と見なした。「陽性」試料の代表的な画像を図40に示す。CFTRを利用する単一の抗体、またはそれぞれ最大3つの抗体の組み合わせに対する、利用可能な抗体の特異性を査定することによって、CFTR免疫組織化学的検査の条件を最適化した。明らかなCFTR特異的シグナルが、抗体596のインキュベーション後に観察された。データは、CFTR陽性上皮細胞が4つのコホートすべての肺組織切片において検出され、免疫組織化学的検査手順によるヒト及びブタのCFTRの検出を示したことを実証する(図41及び45)。低(図42)、中(図43)、及び高(図44)のCFTR発現レベルがコホート3について観察されたが、総合的な所見は、コドン最適化ヒトCFTR SNIM RNAの5mgの処置が、ビヒクル対照と比較してより大きな数のCFTR陽性細胞及び総合的なCFTRシグナル強度をもたらしたことを実証する。データは、10mgの処置後のCFTR発現のさらなる強化も示し、したがって、明らかな用量応答効果を実証する(図45)。CFTR陽性の気管支/細気管支の絶対数及び相対数の定量は、これらの所見をさらに支持し、ビヒクル対照と比較して、5または10mgのヒトCFTR SNIM RNAで処置された動物における有意に高い数を明らかにする(図46)。ヒトCFTR SNIM RNAでの処置後のCFTR発現レベルにおける総合的な上昇を示す。
インサイツのハイブリダイゼーション(ISH)によるCFTR発現分析。FFL陽性組織試料を切除し(コホート内の各ブタにつき最低10の試料)、RNAscope(登録商標)(高度細胞診断)「ZZ」プローブ技術を使用する手動のインサイツのハイブリダイゼーション分析を行った。コドン最適化ヒトCFTR SNIM RNA(配列番号17)のコドン最適化配列に基づいて、プローブを生成した。手短に言えば、RNAscope(登録商標)アッセイは、スライド上に乗せたホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織中の細胞当たりの単一のRNA分子を可視化するように設計された、インサイツのハイブリダイゼーションアッセイである。各包埋組織試料を、製造者のプロトコルに従って前処置し、標的特異的なヒトCFTR特異的RNAプローブとともにインキュベートした。hCFTRプローブは、ヒト、マウス、ラット、ブタ、及びサルとの交差反応性をもって、CFTRに結合することが示された。結合すると、一連の6回の連続増幅を通して、ブローブをシグナル増幅分子のカスケードとハイブリッド形成させる。次にこの試料を、シグナル増幅カセットに特異的なHRP標識化プローブで処置し、3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)を使用して、染色体可視化によってアッセイした。ユビキチンCに特異的なプローブを陽性対照として使用し(図47A及び48A)、一方でdapBを陰性対照として使用した(図47B及び48B)。陽性CFTRシグナルを、無処置、及びビヒクル対照で処置したブタの肺組織のものと比較した(図49A及びB)。染色した試料を、標準的な明視野顕微鏡下で可視化した。データは、1mgのコドン最適化ヒトCFTR SNIM RNAを用いた処置が、ビヒクル対照と比較した場合、コホート2の右(A)及び左(B)の肺組織の両方におけるCFTR発現の劇的な増加をもたらしたことを実証する(図49及び50A&B)。さらに、コホート3及び4について分析された右(A)及び左(B)の肺試料において観測された劇的な増加染色によって実証される通り、5mg及び10mgの処置群について、CFTR発現のさらなる増加が観察された(図51及び52A&B)。まとめると、これらのデータは、吸入を介するmRNAの有効な送達、ならびに肺の両方の葉及びそれらの様々な組織におけるヒトCFTRの発現を強く支持する。
結論。結果は、ルシフェラーゼ及びCFTR mRNAの両方が、肺組織にインビボで有効に送達され得ることを実証した。ルシフェラーゼ発現は、肺の右及び左の葉の両方における異なる領域から採取された様々な組織試料全体で観察された。したがって、噴霧はmRNAの投与に有効な手法であり、かなり均一な分布をもたらすという示唆。さらに、ルシフェラーゼに加えて、CFTR mRNAも肺に効率的に送達され、強化されたタンパク質発現をもたらした。IP−WB、免疫組織化学的検査、及びインサイツのハイブリダイゼーションによって、発現及びタンパク質活性を確認した。各手法は、肺の組織における、mRNA送達ならびにCFTR発現及び/または活性の用量依存的な増加を明らかに実証した。まとめると、実験は、CFTR mRNAをヒト対象の肺に送達するための総合的な実用性及び実行可能性を強調し、治療用途のためのインビボのCFTRタンパク質産生の有効性を実証する。
実施例12:肺におけるインビボの発現
この実施例は、mRNAが充填されたナノ粒子のエアロゾル送達後の肺における成功裏のインビボの発現を実証する。Technical University Munich,Weihenstephan,Germanyから取得したGerman Landraceのブタを使用して、すべての研究を実施した。ブタは35〜90kgの範囲の体重を有した。Pariジェット噴霧器を使用して、FFL/CO−CFTR−C−His10 mRNA製剤またはビヒクル対照を導入した。ブタを屠殺し、所定期間後、mRNAからのタンパク質発現を可能にするため、生理食塩水で灌流した。
伝令RNA合成。この実施例では、コドン最適化ホタルルシフェラーゼ(CO−FFL)mRNAを、プラスミドDNA鋳型からインビトロ転写によって合成した。
cKK−E12製剤。脂質ベースのナノ粒子実験のために、cKK−E12:DOPE:Chol:PEGDMG2K(相対量40:30:25:5(モル比)の製剤中に被包された1mgのFFL+9mgのCO−CFTR−C−His10 mRNAを使用して、脂質製剤を生成した。この溶液を、指示された噴霧器を使用してブタ肺に噴霧した。
エアロゾル適用。エアロゾル(生理食塩水またはCO−FFL cKK−E12製剤)を、麻酔されたブタに噴霧し吸入させた。アザペロン2mg/体重kg、ケタミン15mg/体重kg、アトロピン0.1mg/体重kgの前投薬、続いて外側耳介静脈への静脈ラインの挿入によって、ブタの鎮静を開始した。必要に応じてプロポフォール3〜5mg/体重kgの静脈内注射によって、ブタを麻酔した。必要に応じて麻酔を強化するために、4〜8mg/体重kgのイソフルラン(2〜3%)と1%のプロポフォールのボーラス注入によって麻酔を維持した。麻酔の持続時間はおよそ1〜3時間であった。外側耳静脈を介するペントバルビタール(100mg/体重kg)及び塩化カリウムのボーラス注入でブタを殺処理した。肺を切除し、組織検体を様々な肺領域から採取し、続いて細胞培養培地中で一晩インキュベートした。保管した試料に、生物発光検出を行った。
生物発光分析。ルシフェラーゼ活性の測定のため、組織検体を、管用ルミノメーター内でホモジナイズして分析するか、またはD−ルシフェリン基質を含む培地浴中でインキュベートし、エクスビボルシフェラーゼBLIを行うかのいずれかを行った。(A)FFL/CO−CFTR−C−His10 mRNAで処置されたブタのそれぞれについて、(B)対照ブタからの対照肺組織試料(生理食塩水ビヒクル対照)と比較した場合、強い生物発光シグナルが観察された(図53A&B)。
これらのデータは、FFL/CFTR mRNAが、エアロゾル投与によって肺に成功裏に送達され、肺において発現されたことを示す。
配列の簡単な説明
配列番号1。野生型CFTRアミノ酸配列。
配列番号2。野生型CFTR mRNAコード配列。
配列番号3。非自然発生的CFTR mRNAコード配列番号1。
配列番号4。CFTR mRNA 5’−UTR。
配列番号5。CFTR mRNA 3’−UTR番号1。
配列番号6。FFL 5’UTR。
配列番号7。FFLコード配列。
配列番号8。FFL 3’UTR。
配列番号9。非自然発生的CFTR mRNAコード配列番号2。
配列番号10。非自然発生的CFTR mRNAコード配列番号3。
配列番号11。非自然発生的CFTR mRNAコード配列番号4。
配列番号12。非自然発生的CFTR mRNAコード配列番号5。
配列番号13。非自然発生的CFTR mRNAコード配列番号6。
配列番号14。非自然発生的CFTR mRNAコード配列番号7。
配列番号15。コドン最適化ヒトCFTR C末端His10融合mRNAコード配列。
配列番号16。成長ホルモンリーダー配列を有するコドン最適化ヒトCFTR mRNAコード配列。
配列番号17。コドン最適化ヒトCFTR mRNA
配列番号18。mRNAリーダー配列番号1
配列番号19。mRNAリーダー配列番号2
配列番号20。CFTR mRNA 3’−UTR番号2。

配列番号1
MQRSPLEKASVVSKLFFSWTRPILRKGYRQRLELSDIYQIPSVDSADNLSEKLEREWDRELASKKNPKLINALRRCFFWRFMFYGIFLYLGEVTKAVQPLLLGRIIASYDPDNKEERSIAIYLGIGLCLLFIVRTLLLHPAIFGLHHIGMQMRIAMFSLIYKKTLKLSSRVLDKISIGQLVSLLSNNLNKFDEGLALAHFVWIAPLQVALLMGLIWELLQASAFCGLGFLIVLALFQAGLGRMMMKYRDQRAGKISERLVITSEMIENIQSVKAYCWEEAMEKMIENLRQTELKLTRKAAYVRYFNSSAFFFSGFFVVFLSVLPYALIKGIILRKIFTTISFCIVLRMAVTRQFPWAVQTWYDSLGAINKIQDFLQKQEYKTLEYNLTTTEVVMENVTAFWEEGFGELFEKAKQNNNNRKTSNGDDSLFFSNFSLLGTPVLKDINFKIERGQLLAVAGSTGAGKTSLLMVIMGELEPSEGKIKHSGRISFCSQFSWIMPGTIKENIIFGVSYDEYRYRSVIKACQLEEDISKFAEKDNIVLGEGGITLSGGQRARISLARAVYKDADLYLLDSPFGYLDVLTEKEIFESCVCKLMANKTRILVTSKMEHLKKADKILILHEGSSYFYGTFSELQNLQPDFSSKLMGCDSFDQFSAERRNSILTETLHRFSLEGDAPVSWTETKKQSFKQTGEFGEKRKNSILNPINSIRKFSIVQKTPLQMNGIEEDSDEPLERRLSLVPDSEQGEAILPRISVISTGPTLQARRRQSVLNLMTHSVNQGQNIHRKTTASTRKVSLAPQANLTELDIYSRRLSQETGLEISEEINEEDLKECFFDDMESIPAVTTWNTYLRYITVHKSLIFVLIWCLVIFLAEVAASLVVLWLLGNTPLQDKGNSTHSRNNSYAVIITSTSSYYVFYIYVGVADTLLAMGFFRGLPLVHTLITVSKILHHKMLHSVLQAPMSTLNTLKAGGILNRFSKDIAILDDLLPLTIFDFIQLLLIVIGAIAVVAVLQPYIFVATVPVIVAFIMLRAYFLQTSQQLKQLESEGRSPIFTHLVTSLKGLWTLRAFGRQPYFETLFHKALNLHTANWFLYLSTLRWFQMRIEMIFVIFFIAVTFISILTTGEGEGRVGIILTLAMNIMSTLQWAVNSSIDVDSLMRSVSRVFKFIDMPTEGKPTKSTKPYKNGQLSKVMIIENSHVKKDDIWPSGGQMTVKDLTAKYTEGGNAILENISFSISPGQRVGLLGRTGSGKSTLLSAFLRLLNTEGEIQIDGVSWDSITLQQWRKAFGVIPQKVFIFSGTFRKNLDPYEQWSDQEIWKVADEVGLRSVIEQFPGKLDFVLVDGGCVLSHGHKQLMCLARSVLSKAKILLLDEPSAHLDPVTYQIIRRTLKQAFADCTVILCEHRIEAMLECQQFLVIEENKVRQYDSIQKLLNERSLFRQAISPSDRVKLFPHRNSSKCKSKPQIAALKEETEEEVQDTRL(配列番号1)

配列番号2
AUGCAGAGGUCGCCUCUGGAAAAGGCCAGCGUUGUCUCCAAACUUUUUUUCAGCUGGACCAGACCAAUUUUGAGGAAAGGAUACAGACAGCGCCUGGAAUUGUCAGACAUAUACCAAAUCCCUUCUGUUGAUUCUGCUGACAAUCUAUCUGAAAAAUUGGAAAGAGAAUGGGAUAGAGAGCUGGCUUCAAAGAAAAAUCCUAAACUCAUUAAUGCCCUUCGGCGAUGUUUUUUCUGGAGAUUUAUGUUCUAUGGAAUCUUUUUAUAUUUAGGGGAAGUCACCAAAGCAGUACAGCCUCUCUUACUGGGAAGAAUCAUAGCUUCCUAUGACCCGGAUAACAAGGAGGAACGCUCUAUCGCGAUUUAUCUAGGCAUAGGCUUAUGCCUUCUCUUUAUUGUGAGGACACUGCUCCUACACCCAGCCAUUUUUGGCCUUCAUCACAUUGGAAUGCAGAUGAGAAUAGCUAUGUUUAGUUUGAUUUAUAAGAAGACUUUAAAGCUGUCAAGCCGUGUUCUAGAUAAAAUAAGUAUUGGACAACUUGUUAGUCUCCUUUCCAACAACCUGAACAAAUUUGAUGAAGGACUUGCAUUGGCACAUUUCGUGUGGAUCGCUCCUUUGCAAGUGGCACUCCUCAUGGGGCUAAUCUGGGAGUUGUUACAGGCGUCUGCCUUCUGUGGACUUGGUUUCCUGAUAGUCCUUGCCCUUUUUCAGGCUGGGCUAGGGAGAAUGAUGAUGAAGUACAGAGAUCAGAGAGCUGGGAAGAUCAGUGAAAGACUUGUGAUUACCUCAGAAAUGAUUGAAAAUAUCCAAUCUGUUAAGGCAUACUGCUGGGAAGAAGCAAUGGAAAAAAUGAUUGAAAACUUAAGACAAACAGAACUGAAACUGACUCGGAAGGCAGCCUAUGUGAGAUACUUCAAUAGCUCAGCCUUCUUCUUCUCAGGGUUCUUUGUGGUGUUUUUAUCUGUGCUUCCCUAUGCACUAAUCAAAGGAAUCAUCCUCCGGAAAAUAUUCACCACCAUCUCAUUCUGCAUUGUUCUGCGCAUGGCGGUCACUCGGCAAUUUCCCUGGGCUGUACAAACAUGGUAUGACUCUCUUGGAGCAAUAAACAAAAUACAGGAUUUCUUACAAAAGCAAGAAUAUAAGACAUUGGAAUAUAACUUAACGACUACAGAAGUAGUGAUGGAGAAUGUAACAGCCUUCUGGGAGGAGGGAUUUGGGGAAUUAUUUGAGAAAGCAAAACAAAACAAUAACAAUAGAAAAACUUCUAAUGGUGAUGACAGCCUCUUCUUCAGUAAUUUCUCACUUCUUGGUACUCCUGUCCUGAAAGAUAUUAAUUUCAAGAUAGAAAGAGGACAGUUGUUGGCGGUUGCUGGAUCCACUGGAGCAGGCAAGACUUCACUUCUAAUGAUGAUUAUGGGAGAACUGGAGCCUUCAGAGGGUAAAAUUAAGCACAGUGGAAGAAUUUCAUUCUGUUCUCAGUUUUCCUGGAUUAUGCCUGGCACCAUUAAAGAAAAUAUCAUCUUUGGUGUUUCCUAUGAUGAAUAUAGAUACAGAAGCGUCAUCAAAGCAUGCCAACUAGAAGAGGACAUCUCCAAGUUUGCAGAGAAAGACAAUAUAGUUCUUGGAGAAGGUGGAAUCACACUGAGUGGAGGUCAACGAGCAAGAAUUUCUUUAGCAAGAGCAGUAUACAAAGAUGCUGAUUUGUAUUUAUUAGACUCUCCUUUUGGAUACCUAGAUGUUUUAACAGAAAAAGAAAUAUUUGAAAGCUGUGUCUGUAAACUGAUGGCUAACAAAACUAGGAUUUUGGUCACUUCUAAAAUGGAACAUUUAAAGAAAGCUGACAAAAUAUUAAUUUUGAAUGAAGGUAGCAGCUAUUUUUAUGGGACAUUUUCAGAACUCCAAAAUCUACAGCCAGACUUUAGCUCAAAACUCAUGGGAUGUGAUUCUUUCGACCAAUUUAGUGCAGAAAGAAGAAAUUCAAUCCUAACUGAGACCUUACACCGUUUCUCAUUAGAAGGAGAUGCUCCUGUCUCCUGGACAGAAACAAAAAAACAAUCUUUUAAACAGACUGGAGAGUUUGGGGAAAAAAGGAAGAAUUCUAUUCUCAAUCCAAUCAACUCUAUACGAAAAUUUUCCAUUGUGCAAAAGACUCCCUUACAAAUGAAUGGCAUCGAAGAGGAUUCUGAUGAGCCUUUAGAGAGAAGGCUGUCCUUAGUACCAGAUUCUGAGCAGGGAGAGGCGAUACUGCCUCGCAUCAGCGUGAUCAGCACUGGCCCCACGCUUCAGGCACGAAGGAGGCAGUCUGUCCUGAACCUGAUGACACACUCAGUUAACCAAGGUCAGAACAUUCACCGAAAGACAACAGCAUCCACACGAAAAGUGUCACUGGCCCCUCAGGCAAACUUGACUGAACUGGAUAUAUAUUCAAGAAGGUUAUCUCAAGAAACUGGCUUGGAAAUAAGUGAAGAAAUUAACGAAGAAGACUUAAAGGAGUGCCUUUUUGAUGAUAUGGAGAGCAUACCAGCAGUGACUACAUGGAACACAUACCUUCGAUAUAUUACUGUCCACAAGAGCUUAAUUUUUGUGCUAAUUUGGUGCUUAGUAAUUUUUCUGGCAGAGGUGGCUGCUUCUUUGGUUGUGCUGUGGCUCCUUGGAAACACUCCUCUUCAAGACAAAGGGAAUAGUACUCAUAGUAGAAAUAACAGCUAUGCAGUGAUUAUCACCAGCACCAGUUCGUAUUAUGUGUUUUACAUUUACGUGGGAGUAGCCGACACUUUGCUUGCUAUGGGAUUCUUCAGAGGUCUACCACUGGUGCAUACUCUAAUCACAGUGUCGAAAAUUUUACACCACAAAAUGUUACAUUCUGUUCUUCAAGCACCUAUGUCAACCCUCAACACGUUGAAAGCAGGUGGGAUUCUUAAUAGAUUCUCCAAAGAUAUAGCAAUUUUGGAUGACCUUCUGCCUCUUACCAUAUUUGACUUCAUCCAGUUGUUAUUAAUUGUGAUUGGAGCUAUAGCAGUUGUCGCAGUUUUACAACCCUACAUCUUUGUUGCAACAGUGCCAGUGAUAGUGGCUUUUAUUAUGUUGAGAGCAUAUUUCCUCCAAACCUCACAGCAACUCAAACAACUGGAAUCUGAAGGCAGGAGUCCAAUUUUCACUCAUCUUGUUACAAGCUUAAAAGGACUAUGGACACUUCGUGCCUUCGGACGGCAGCCUUACUUUGAAACUCUGUUCCACAAAGCUCUGAAUUUACAUACUGCCAACUGGUUCUUGUACCUGUCAACACUGCGCUGGUUCCAAAUGAGAAUAGAAAUGAUUUUUGUCAUCUUCUUCAUUGCUGUUACCUUCAUUUCCAUUUUAACAACAGGAGAAGGAGAAGGAAGAGUUGGUAUUAUCCUGACUUUAGCCAUGAAUAUCAUGAGUACAUUGCAGUGGGCUGUAAACUCCAGCAUAGAUGUGGAUAGCUUGAUGCGAUCUGUGAGCCGAGUCUUUAAGUUCAUUGACAUGCCAACAGAAGGUAAACCUACCAAGUCAACCAAACCAUACAAGAAUGGCCAACUCUCGAAAGUUAUGAUUAUUGAGAAUUCACACGUGAAGAAAGAUGACAUCUGGCCCUCAGGGGGCCAAAUGACUGUCAAAGAUCUCACAGCAAAAUACACAGAAGGUGGAAAUGCCAUAUUAGAGAACAUUUCCUUCUCAAUAAGUCCUGGCCAGAGGGUGGGCCUCUUGGGAAGAACUGGAUCAGGGAAGAGUACUUUGUUAUCAGCUUUUUUGAGACUACUGAACACUGAAGGAGAAAUCCAGAUCGAUGGUGUGUCUUGGGAUUCAAUAACUUUGCAACAGUGGAGGAAAGCCUUUGGAGUGAUACCACAGAAAGUAUUUAUUUUUUCUGGAACAUUUAGAAAAAACUUGGAUCCCUAUGAACAGUGGAGUGAUCAAGAAAUAUGGAAAGUUGCAGAUGAGGUUGGGCUCAGAUCUGUGAUAGAACAGUUUCCUGGGAAGCUUGACUUUGUCCUUGUGGAUGGGGGCUGUGUCCUAAGCCAUGGCCACAAGCAGUUGAUGUGCUUGGCUAGAUCUGUUCUCAGUAAGGCGAAGAUCUUGCUGCUUGAUGAACCCAGUGCUCAUUUGGAUCCAGUAACAUACCAAAUAAUUAGAAGAACUCUAAAACAAGCAUUUGCUGAUUGCACAGUAAUUCUCUGUGAACACAGGAUAGAAGCAAUGCUGGAAUGCCAACAAUUUUUGGUCAUAGAAGAGAACAAAGUGCGGCAGUACGAUUCCAUCCAGAAACUGCUGAACGAGAGGAGCCUCUUCCGGCAAGCCAUCAGCCCCUCCGACAGGGUGAAGCUCUUUCCCCACCGGAACUCAAGCAAGUGCAAGUCUAAGCCCCAGAUUGCUGCUCUGAAAGAGGAGACAGAAGAAGAGGUGCAAGAUACAAGGCUUUAG(配列番号2)

配列番号3
AUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAACUCUUCUUCUCAUGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGACCGCGAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGAGAAGGUGCUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGGGAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCGCCUCGUACGACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUACCUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGUUGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAUCACAUCGGUAUGCAGAUGCGAAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAACUCUCGUCGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCCCUGCUUAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUUUCGUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUAUUUGGGAGCUGUUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUCUGAUUGUGUUGGCAUUGUUUCAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAUGAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAAAUCUCGGAAAGACUCGUCAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCAAAGCCUAUUGCUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCCGCCAAACUGAGCUGAAACUGACCCGCAAGGCGGCGUAUGUCCGGUAUUUCAAUUCGUCAGCGUUCUUCUUUUCCGGGUUCUUCGUUGUCUUUCUCUCGGUUUUGCCUUAUGCCUUGAUUAAGGGGAUUAUCCUCCGCAAGAUUUUCACCACGAUUUCGUUCUGCAUUGUAUUGCGCAUGGCAGUGACACGGCAAUUUCCGUGGGCCGUGCAGACAUGGUAUGACUCGCUUGGAGCGAUCAACAAAAUCCAAGACUUCUUGCAAAAGCAAGAGUACAAGACCCUGGAGUACAAUCUUACUACUACGGAGGUAGUAAUGGAGAAUGUGACGGCUUUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGAAAGCAAAGCAGAAUAACAACAACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAUUCCCUGUUUUUCUCGAACUUCUCCCUGCUCGGAACACCCGUGUUGAAGGACAUCAAUUUCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUCUCGCGGUAGCGGGAAGCACUGGUGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUAUGGGGGAGCUUGAGCCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUAUCUCAUUCUGUAGCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAAGAGAACAUCAUUUUCGGAGUAUCCUAUGAUGAGUACCGAUACAGAUCGGUCAUUAAGGCGUGCCAGUUGGAAGAGGACAUUUCUAAGUUCGCCGAGAAGGAUAACAUCGUCUUGGGAGAAGGGGGUAUUACAUUGUCGGGAGGGCAGCGAGCGCGGAUCAGCCUCGCGAGAGCGGUAUACAAAGAUGCAGAUUUGUAUCUGCUUGAUUCACCGUUUGGAUACCUCGACGUAUUGACAGAAAAAGAAAUCUUCGAGUCGUGCGUGUGUAAACUUAUGGCUAAUAAGACGAGAAUCCUGGUGACAUCAAAAAUGGAACACCUUAAGAAGGCGGACAAGAUCCUGAUCCUCCACGAAGGAUCGUCCUACUUUUACGGCACUUUCUCAGAGUUGCAAAACUUGCAGCCGGACUUCUCAAGCAAACUCAUGGGGUGUGACUCAUUCGACCAGUUCAGCGCGGAACGGCGGAACUCGAUCUUGACGGAAACGCUGCACCGAUUCUCGCUUGAGGGUGAUGCCCCGGUAUCGUGGACCGAGACAAAGAAGCAGUCGUUUAAGCAGACAGGAGAAUUUGGUGAGAAAAGAAAGAACAGUAUCUUGAAUCCUAUUAACUCAAUUCGCAAGUUCUCAAUCGUCCAGAAAACUCCACUGCAGAUGAAUGGAAUUGAAGAGGAUUCGGACGAACCCCUGGAGCGCAGGCUUAGCCUCGUGCCGGAUUCAGAGCAAGGGGAGGCCAUUCUUCCCCGGAUUUCGGUGAUUUCAACCGGACCUACACUUCAGGCGAGGCGAAGGCAAUCCGUGCUCAACCUCAUGACGCAUUCGGUAAACCAGGGGCAAAACAUUCACCGCAAAACGACGGCCUCAACGAGAAAAGUGUCACUUGCACCCCAGGCGAAUUUGACUGAACUCGACAUCUACAGCCGUAGGCUUUCGCAAGAAACCGGACUUGAGAUCAGCGAAGAAAUCAAUGAAGAAGAUUUGAAAGAGUGUUUCUUUGAUGACAUGGAAUCAAUCCCAGCGGUGACAACGUGGAACACAUACUUGCGUUACAUCACGGUGCACAAGUCCUUGAUUUUCGUCCUCAUCUGGUGUCUCGUGAUCUUUCUCGCUGAGGUCGCAGCGUCACUUGUGGUCCUCUGGCUGCUUGGUAAUACGCCCUUGCAAGACAAAGGCAAUUCUACACACUCAAGAAACAAUUCCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCUACAAGCUCGUAUUACGUGUUUUACAUCUACGUAGGAGUGGCCGACACUCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCCGAGGACUCCCACUCGUUCACACGCUUAUCACUGUCUCCAAGAUUCUCCACCAUAAGAUGCUUCAUAGCGUACUGCAGGCUCCCAUGUCCACCUUGAAUACGCUCAAGGCGGGAGGUAUUUUGAAUCGCUUCUCAAAAGAUAUUGCAAUUUUGGAUGACCUUCUGCCCCUGACGAUCUUCGACUUCAUCCAGUUGUUGCUGAUCGUGAUUGGGGCUAUUGCAGUAGUCGCUGUCCUCCAGCCUUACAUUUUUGUCGCGACCGUUCCGGUGAUCGUGGCGUUUAUCAUGCUGCGGGCCUAUUUCUUGCAGACGUCACAGCAGCUUAAGCAACUGGAGUCUGAAGGGAGGUCGCCUAUCUUUACGCAUCUUGUGACCAGUUUGAAGGGAUUGUGGACGUUGCGCGCCUUUGGCAGGCAGCCCUACUUUGAAACACUGUUCCACAAAGCGCUGAAUCUCCAUACGGCAAAUUGGUUUUUGUAUUUGAGUACCCUCCGAUGGUUUCAGAUGCGCAUUGAGAUGAUUUUUGUGAUCUUCUUUAUCGCGGUGACUUUUAUCUCCAUCUUGACCACGGGAGAGGGCGAGGGACGGGUCGGUAUUAUCCUGACACUCGCCAUGAACAUUAUGAGCACUUUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUUGAUGUGGAUAGCCUGAUGAGGUCCGUUUCGAGGGUCUUUAAGUUCAUCGACAUGCCGACGGAGGGAAAGCCCACAAAAAGUACGAAACCCUAUAAGAAUGGGCAAUUGAGUAAGGUAAUGAUCAUCGAGAACAGUCACGUGAAGAAGGAUGACAUCUGGCCUAGCGGGGGUCAGAUGACCGUGAAGGACCUGACGGCAAAAUACACCGAGGGAGGGAACGCAAUCCUUGAAAACAUCUCGUUCAGCAUUAGCCCCGGUCAGCGUGUGGGGUUGCUCGGGAGGACCGGGUCAGGAAAAUCGACGUUGCUGUCGGCCUUCUUGAGACUUCUGAAUACAGAGGGUGAGAUCCAGAUCGACGGCGUUUCGUGGGAUAGCAUCACCUUGCAGCAGUGGCGGAAAGCGUUUGGAGUAAUCCCCCAAAAGGUCUUUAUCUUUAGCGGAACCUUCCGAAAGAAUCUCGAUCCUUAUGAACAGUGGUCAGAUCAAGAGAUUUGGAAAGUCGCGGACGAGGUUGGCCUUCGGAGUGUAAUCGAGCAGUUUCCGGGAAAACUCGACUUUGUCCUUGUAGAUGGGGGAUGCGUCCUGUCGCAUGGGCACAAGCAGCUCAUGUGCCUGGCGCGAUCCGUCCUCUCUAAAGCGAAAAUUCUUCUCUUGGAUGAACCUUCGGCCCAUCUGGACCCGGUAACGUAUCAGAUCAUCAGAAGGACACUUAAGCAGGCGUUUGCCGACUGCACGGUGAUUCUCUGUGAGCAUCGUAUCGAGGCCAUGCUCGAAUGCCAGCAAUUUCUUGUCAUCGAAGAGAAUAAGGUCCGCCAGUACGACUCCAUCCAGAAGCUGCUUAAUGAGAGAUCAUUGUUCCGGCAGGCGAUUUCACCAUCCGAUAGGGUGAAACUUUUUCCACACAGAAAUUCGUCGAAGUGCAAGUCCAAACCGCAGAUCGCGGCCUUGAAAGAAGAGACUGAAGAAGAAGUUCAAGACACGCGUCUUUAA(配列番号3)

配列番号4
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG(配列番号4)

配列番号5
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC(配列番号5)

配列番号6
GGGAUCCUACC(配列番号6)

配列番号7
AUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGUGAGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAUACAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGUACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGUACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUA(配列番号7)

配列番号8
UUUGAAUU(配列番号8)

配列番号9
AUGCAGAGAAGCCCCCUGGAAAAGGCCAGCGUGGUGUCCAAGCUGUUCUUCAGCUGGACCAGACCCAUCCUGAGAAAGGGCUACAGACAGAGACUGGAACUGAGCGACAUCUACCAGAUCCCCAGCGUGGACAGCGCCGACAACCUGAGCGAGAAGCUGGAAAGAGAGUGGGACAGAGAGCUGGCUAGCAAGAAGAACCCCAAGCUGAUCAACGCCCUGAGGCGGUGCUUCUUCUGGCGGUUUAUGUUCUACGGCAUCUUCCUGUACCUGGGCGAAGUGACAAAGGCCGUGCAGCCCCUGCUCCUGGGCAGAAUCAUUGCCAGCUACGACCCCGACAACAAAGAGGAAAGAUCUAUCGCCAUCUACCUGGGCAUCGGCCUGUGCCUGCUGUUCAUCGUGCGGACACUGCUGCUGCACCCCGCCAUCUUCGGCCUGCACCACAUCGGCAUGCAGAUGAGAAUCGCCAUGUUCAGCCUGAUCUACAAGAAAACCCUGAAGCUGAGCAGCAGGGUGCUGGACAAGAUCAGCAUCGGACAGCUGGUGUCCCUGCUGAGCAACAACCUGAACAAGUUCGACGAGGGACUGGCCCUGGCUCACUUCGUGUGGAUCGCUCCACUGCAGGUCGCCCUGCUGAUGGGCCUGAUCUGGGAGCUGCUGCAGGCCAGCGCUUUCUGCGGCCUGGGCUUUCUGAUUGUGCUGGCCCUGUUUCAGGCUGGCCUGGGCAGGAUGAUGAUGAAGUACAGGGACCAGAGAGCCGGCAAGAUCAGCGAGAGACUGGUCAUCACCAGCGAGAUGAUCGAGAACAUCCAGAGCGUGAAGGCCUACUGCUGGGAAGAGGCCAUGGAAAAGAUGAUCGAAAACCUGAGACAGACCGAGCUGAAGCUGACCAGAAAGGCCGCCUACGUGCGGUACUUCAACAGCAGCGCCUUCUUCUUCUCCGGCUUCUUCGUGGUGUUCCUGUCCGUGCUGCCCUACGCCCUGAUCAAGGGCAUCAUCCUGAGGAAGAUCUUCACCACCAUUUCUUUCUGCAUCGUGCUGAGAAUGGCCGUGACCAGACAGUUCCCCUGGGCCGUGCAGACUUGGUACGACAGCCUGGGCGCCAUCAACAAGAUCCAGGACUUCCUGCAGAAGCAGGAGUACAAGACCCUCGAGUACAACCUGACCACCACCGAGGUGGUCAUGGAAAACGUGACCGCCUUCUGGGAGGAAGGCUUCGGCGAGCUGUUCGAGAAGGCCAAGCAGAACAACAACAACAGAAAGACCAGCAACGGCGACGACUCCCUGUUCUUCUCCAACUUCUCCCUGCUGGGCACCCCCGUGCUGAAGGACAUCAACUUCAAGAUCGAGAGAGGCCAGCUGCUCGCCGUGGCCGGCUCUACAGGCGCUGGCAAGACCUCUCUGCUGAUGGUCAUCAUGGGCGAGCUGGAACCCAGCGAGGGCAAGAUCAAGCACAGCGGCAGAAUCAGCUUCUGCAGCCAGUUCAGCUGGAUCAUGCCCGGCACCAUCAAAGAGAACAUCAUCUUCGGCGUGUCCUACGACGAGUACAGAUACAGAAGCGUGAUCAAGGCCUGCCAGCUGGAAGAGGACAUCAGCAAGUUCGCCGAGAAGGACAACAUCGUGCUGGGCGAGGGCGGCAUCACCCUGUCUGGCGGCCAGAGAGCCAGAAUCAGCCUGGCCAGAGCCGUGUACAAGGACGCCGACCUGUACCUGCUGGACAGCCCCUUCGGCUACCUGGACGUGCUGACCGAGAAAGAGAUCUUCGAGAGCUGCGUGUGCAAGCUGAUGGCCAACAAGACCAGAAUCCUGGUCACCAGCAAGAUGGAACACCUGAAGAAGGCCGACAAGAUCCUGAUCCUGCACGAGGGCAGCAGCUACUUCUACGGCACAUUCAGCGAGCUGCAGAACCUGCAGCCCGACUUCAGCAGCAAACUGAUGGGCUGCGACAGCUUCGACCAGUUCAGCGCCGAGAGAAGAAACAGCAUCCUGACCGAGACACUGCACAGAUUCAGCCUGGAAGGCGACGCCCCCGUGUCUUGGACCGAGACAAAGAAGCAGAGCUUCAAGCAGACCGGCGAGUUCGGCGAGAAGAGAAAGAACUCCAUCCUGAACCCCAUCAACAGCAUCCGGAAGUUCAGCAUCGUGCAGAAAACCCCCCUGCAGAUGAACGGCAUCGAAGAGGACAGCGACGAGCCCCUGGAAAGACGGCUGAGCCUGGUGCCUGACAGCGAGCAGGGCGAGGCCAUCCUGCCUAGAAUCAGCGUGAUCAGCACCGGCCCCACCCUGCAGGCUAGAAGGCGGCAGAGCGUGCUGAACCUGAUGACCCACAGCGUGAACCAGGGCCAGAACAUCCACCGCAAGACCACCGCCAGCACCAGAAAGGUGUCCCUGGCUCCUCAGGCCAACCUGACCGAGCUGGACAUCUACAGCAGAAGGCUGAGCCAGGAAACCGGCCUGGAAAUCAGCGAGGAAAUCAACGAAGAGGACCUGAAAGAGUGCUUCUUCGACGACAUGGAAUCCAUCCCCGCCGUGACCACCUGGAACACCUACCUGCGGUACAUCACCGUGCACAAGAGCCUGAUCUUCGUGCUGAUCUGGUGCCUGGUCAUCUUCCUGGCCGAGGUGGCCGCCAGCCUGGUGGUGCUGUGGCUCCUGGGAAACACCCCUCUGCAGGACAAGGGCAACAGCACCCACAGCAGAAACAACAGCUACGCCGUGAUCAUCACCUCCACCAGCUCCUACUACGUGUUCUACAUCUACGUGGGCGUGGCCGACACCCUGCUGGCUAUGGGCUUCUUCAGAGGCCUGCCCCUGGUGCACACCCUGAUCACCGUGUCCAAGAUCCUGCACCAUAAGAUGCUGCACAGCGUGCUGCAGGCUCCCAUGAGCACCCUGAACACACUGAAGGCUGGCGGCAUCCUGAACAGGUUCAGCAAGGAUAUCGCCAUCCUGGACGACCUGCUGCCUCUGACCAUCUUCGACUUCAUCCAGCUGCUGCUGAUCGUGAUCGGCGCUAUCGCCGUGGUGGCCGUGCUGCAGCCCUACAUCUUCGUGGCCACCGUGCCCGUGAUCGUGGCCUUCAUUAUGCUGAGAGCCUACUUUCUGCAGACCAGCCAGCAGCUGAAGCAGCUGGAAAGCGAGGGCAGAAGCCCCAUCUUCACCCACCUCGUGACCAGCCUGAAGGGCCUGUGGACCCUGAGAGCCUUCGGCAGACAGCCCUACUUCGAGACACUGUUCCACAAGGCCCUGAACCUGCACACCGCCAACUGGUUUCUGUACCUGUCCACCCUGAGAUGGUUCCAGAUGAGGAUCGAGAUGAUCUUCGUCAUCUUCUUUAUCGCCGUGACCUUCAUCUCUAUCCUGACCACCGGCGAGGGCGAGGGAAGAGUGGGAAUCAUCCUGACCCUGGCCAUGAACAUCAUGAGCACACUGCAGUGGGCCGUGAACAGCAGCAUCGACGUGGACAGCCUGAUGAGAAGCGUGUCCAGAGUGUUCAAGUUCAUCGACAUGCCUACCGAGGGCAAGCCCACCAAGAGCACCAAGCCCUACAAGAACGGCCAGCUGAGCAAAGUGAUGAUCAUCGAGAACAGCCACGUCAAGAAGGACGACAUCUGGCCCAGCGGCGGACAGAUGACCGUGAAGGACCUGACCGCCAAGUACACAGAGGGCGGCAACGCUAUCCUGGAAAACAUCAGCUUCAGCAUCAGCCCAGGCCAGAGAGUGGGCCUGCUGGGGAGAACAGGCAGCGGCAAGUCUACCCUGCUGUCCGCCUUCCUGAGACUGCUGAACACCGAGGGCGAGAUCCAGAUCGAUGGCGUGUCCUGGGACUCCAUCACCCUGCAGCAGUGGCGCAAGGCCUUCGGCGUGAUCCCCCAGAAGGUGUUCAUCUUCAGCGGCACCUUCAGAAAGAACCUGGACCCCUACGAGCAGUGGUCCGACCAGGAAAUCUGGAAGGUCGCCGAUGAAGUGGGCCUGAGAUCCGUGAUCGAGCAGUUCCCCGGCAAGCUGGACUUCGUGCUGGUGGACGGCGGCUGCGUGCUGAGCCACGGCCACAAGCAGCUGAUGUGUCUGGCCCGCUCCGUGCUGAGCAAGGCUAAGAUUCUGCUGCUGGACGAGCCUAGCGCCCACCUGGACCCUGUGACCUACCAGAUCAUCAGAAGGACCCUGAAGCAGGCCUUCGCCGACUGCACCGUGAUCCUGUGCGAGCACAGAAUCGAGGCCAUGCUGGAAUGCCAGCAGUUCCUGGUCAUCGAAGAGAACAAAGUGCGGCAGUACGACAGCAUCCAGAAGCUGCUGAACGAGAGAAGCCUGUUCAGACAGGCCAUCAGCCCCAGCGACAGAGUGAAGCUGUUCCCCCACCGCAACAGCAGCAAGUGCAAGAGCAAGCCCCAGAUCGCCGCCCUGAAAGAAGAGACUGAGGAAGAGGUGCAGGACACCAGACUGUGA(配列番号9)

配列番号10
AUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAACUCUUCUUCUCAUGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGACCGCGAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGAGAAGGUGCUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGGGAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCGCCUCGUACGACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUACCUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGUUGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAUCACAUCGGUAUGCAGAUGCGAAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAACUCUCGUCGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCCCUGCUUAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUUUCGUGUGGAUUGCCCCGCUGCAAGUCGCACUGCUUAUGGGACUGAUUUGGGAACUGUUGCAGGCCAGCGCCUUUUGCGGCCUGGGAUUUCUCAUUGUGCUUGCACUUUUCCAAGCAGGGCUCGGCAGAAUGAUGAUGAAGUACAGGGACCAGAGAGCCGGAAAGAUCUCAGAACGGCUCGUGAUUACUUCAGAAAUGAUCGAGAACAUUCAAUCGGUGAAAGCGUACUGCUGGGAAGAGGCGAUGGAAAAGAUGAUCGAAAACCUCAGACAGACCGAGUUGAAGCUGACCCGGAAGGCCGCGUACGUCAGAUACUUCAACAGCAGCGCUUUCUUCUUCUCGGGCUUCUUCGUCGUGUUCCUGUCGGUGCUGCCGUAUGCCCUCAUUAAGGGAAUUAUCUUGCGGAAGAUCUUUACUACUAUCUCAUUUUGCAUCGUCCUUCGGAUGGCGGUCACUCGGCAGUUCCCGUGGGCCGUGCAGACCUGGUACGACAGCCUCGGGGCCAUCAACAAGAUCCAAGACUUUCUCCAAAAGCAAGAGUACAAAACCCUCGAAUACAACCUCACCACUACUGAAGUGGUCAUGGAAAACGUGACCGCCUUUUGGGAAGAAGGCUUCGGAGAACUGUUCGAGAAGGCGAAGCAAAACAACAAUAAUCGCAAGACUAGCAACGGGGAUGACUCACUGUUCUUCAGCAAUUUCUCACUGCUCGGCACCCCGGUGCUUAAGGACAUCAACUUCAAGAUUGAACGCGGACAGCUCUUGGCGGUGGCCGGAUCCACCGGAGCAGGAAAGACUAGCCUGCUGAUGGUGAUCAUGGGUGAGCUGGAACCGUCCGAAGGCAAAAUCAAGCACUCCGGCAGAAUCAGCUUCUGCUCGCAGUUUUCGUGGAUCAUGCCAGGAACCAUCAAAGAGAACAUCAUCUUUGGAGUCUCAUACGAUGAGUACCGCUACAGAAGCGUGAUUAAGGCCUGCCAGCUUGAAGAGGACAUCUCCAAGUUCGCGGAAAAGGACAACAUCGUGCUGGGUGAGGGAGGGAUCACGUUGUCGGGCGGUCAGAGAGCCCGCAUUUCGCUGGCACGGGCUGUGUACAAGGAUGCGGAUCUUUACCUUCUGGACUCGCCAUUCGGUUACCUCGACGUGCUGACCGAAAAAGAAAUCUUCGAGAGCUGCGUGUGUAAGCUGAUGGCUAAUAAGACUAGAAUCCUCGUGACGUCCAAAAUGGAACAUCUUAAGAAGGCGGAUAAGAUUCUCAUUCUUCACGAGGGGUCGAGCUACUUCUACGGGACUUUUAGCGAGCUGCAGAAUUUGCAGCCGGACUUCAGCUCAAAGCUCAUGGGCUGCGACUCGUUCGAUCAGUUCAGCGCCGAACGGCGCAAUUCGAUCUUGACGGAAACCCUGCACAGAUUCUCGCUGGAGGGAGAUGCACCUGUCUCGUGGACCGAAACCAAGAAGCAGUCCUUCAAGCAGACGGGAGAGUUCGGAGAAAAGCGGAAGAACUCAAUCCUCAACCCAAUCAACUCCAUUCGCAAAUUCUCAAUCGUGCAGAAAACUCCACUGCAGAUGAACGGUAUCGAAGAGGAUUCGGACGAGCCACUUGAGCGGAGACUGUCGCUGGUGCCAGAUUCAGAACAGGGGGAGGCAAUCCUGCCGCGCAUUUCCGUGAUCAGCACUGGGCCGACCCUCCAAGCUAGACGCAGGCAAUCAGUGCUGAAUCUCAUGACCCACUCCGUCAACCAGGGACAGAAUAUCCACCGCAAGACCACCGCGUCGACUAGAAAGGUGUCAUUGGCACCGCAAGCAAAUUUGACUGAACUUGACAUCUACUCACGGCGCCUCUCCCAAGAAACCGGAUUGGAAAUCUCCGAAGAGAUUAACGAAGAAGAUUUGAAAGAGUGUUUCUUCGACGAUAUGGAGUCGAUCCCCGCAGUGACCACUUGGAAUACGUAUCUUCGGUACAUCACCGUGCACAAGAGCCUGAUCUUCGUCCUCAUCUGGUGCCUGGUGAUCUUUCUGGCCGAAGUCGCCGCUUCGCUGGUCGUGCUGUGGCUGCUCGGUAAUACCCCGCUCCAAGACAAAGGCAAUUCCACUCACUCGCGCAACAACAGCUACGCUGUGAUUAUCACGUCAACCUCGUCGUACUAUGUGUUCUACAUCUACGUGGGAGUCGCGGACACUCUGCUCGCUAUGGGCUUCUUUCGCGGACUGCCCCUGGUCCACACUCUCAUCACGGUGAGCAAGAUCCUCCAUCAUAAGAUGCUCCAUUCCGUGCUGCAGGCCCCGAUGAGCACUCUCAACACUCUGAAGGCGGGUGGAAUCUUGAACAGAUUUUCCAAAGACAUCGCGAUUCUGGACGAUCUGCUCCCACUCACUAUCUUCGACUUCAUCCAACUGCUGCUGAUCGUCAUCGGAGCUAUCGCCGUGGUGGCUGUCCUCCAGCCGUAUAUCUUCGUGGCCACUGUGCCGGUGAUUGUCGCUUUCAUCAUGUUGCGCGCGUACUUCUUGCAAACCUCGCAGCAACUCAAGCAACUGGAGUCCGAGGGCCGGAGCCCAAUCUUUACCCAUCUGGUGACUUCACUGAAAGGUCUGUGGACCCUCCGCGCCUUUGGUCGCCAGCCUUACUUCGAAACUCUCUUUCACAAAGCACUGAAUCUCCACACUGCAAACUGGUUCUUGUACCUGUCCACCCUGCGGUGGUUCCAAAUGCGGAUCGAGAUGAUCUUUGUCAUCUUCUUCAUCGCCGUGACUUUUAUCUCCAUCCUCACCACCGGCGAGGGAGAGGGGAGAGUGGGAAUCAUCCUGACGCUGGCGAUGAAUAUCAUGUCCACUUUGCAGUGGGCCGUCAAUUCGAGCAUCGACGUGGAUUCGCUGAUGCGCAGCGUGUCGCGCGUGUUCAAGUUCAUCGAUAUGCCCACCGAAGGUAAACCCACCAAGAGCACGAAGCCUUACAAGAACGGGCAGCUCUCAAAGGUGAUGAUUAUCGAGAACUCCCAUGUGAAGAAGGACGACAUCUGGCCAUCCGGAGGACAGAUGACCGUGAAGGACCUGACCGCCAAAUACACGGAGGGCGGAAAUGCAAUCCUCGAAAACAUCUCGUUCUCCAUCUCGCCUGGCCAAAGGGUGGGACUUUUGGGACGCACUGGAUCCGGAAAGAGCACCCUGCUUAGCGCCUUCUUGAGGCUCUUGAACACCGAGGGCGAAAUCCAGAUCGAUGGCGUGUCGUGGGAUUCGAUCACCCUGCAGCAGUGGAGAAAGGCCUUCGGGGUGAUCCCGCAAAAAGUGUUCAUCUUCUCCGGAACGUUUCGGAAAAACCUUGACCCAUACGAACAAUGGUCGGAUCAAGAGAUUUGGAAGGUCGCCGACGAAGUGGGGCUGCGCUCCGUGAUCGAGCAGUUUCCGGGAAAACUGGACUUCGUCUUGGUCGACGGCGGAUGCGUCCUGUCCCACGGACAUAAGCAGCUGAUGUGCCUGGCCCGCAGCGUCCUUUCAAAAGCUAAGAUCCUGCUGCUGGAUGAACCUUCAGCACACCUCGACCCGGUCACCUACCAGAUCAUCAGACGGACCCUGAAACAGGCCUUUGCGGAUUGUACUGUGAUCUUGUGUGAACACCGCAUUGAAGCCAUGCUGGAGUGCCAGCAGUUCCUGGUCAUCGAAGAGAACAAAGUGCGGCAGUACGAUUCCAUCCAAAAACUGCUCAAUGAGCGGUCCCUGUUCAGACAGGCAAUUAGCCCGAGCGACAGGGUCAAAUUGUUCCCCCAUAGAAAUUCGUCGAAAUGUAAGUCAAAGCCUCAGAUCGCGGCACUGAAAGAAGAAACUGAAGAAGAGGUGCAAGACACCAGACUGUGA(配列番号10)

配列番号11
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配列番号12
AUGCAGCGGUCCCCUCUGGAGAAGGCUUCCGUGGUCAGCAAGCUGUUCUUCUCGUGGACCAGACCUAUCCUCCGCAAGGGAUACCGCCAGCGCCUGGAGCUGUCAGAUAUCUACCAGAUCCCAAGCGUGGACUCAGCCGACAAUCUGAGCGAAAAGCUGGAACGGGAGUGGGACCGGGAGCUCGCCUCCAAGAAGAAUCCGAAGUUGAUCAAUGCGCUGCGCAGAUGCUUCUUCUGGCGGUUUAUGUUUUACGGCAUCUUUCUGUAUCUCGGAGAAGUGACCAAAGCCGUGCAGCCGCUGCUCUUGGGUAGGAUCAUUGCUUCGUACGACCCGGACAACAAAGAAGAACGCUCCAUCGCCAUCUACCUCGGAAUCGGUCUGUGCCUGCUCUUUAUCGUGCGCACUCUCCUGCUGCAUCCGGCGAUCUUCGGACUGCACCACAUCGGCAUGCAAAUGCGGAUCGCAAUGUUCUCACUGAUCUACAAAAAGACUCUGAAGCUCAGCUCCAGAGUGCUGGAUAAGAUCUCGAUCGGGCAACUCGUCAGCCUGCUGUCGAACAAUCUGAAUAAGUUCGACGAAGGGUUGGCCCUCGCACAUUUCGUGUGGAUCGCACCGCUGCAAGUGGCGCUCCUGAUGGGACUCAUUUGGGAACUGCUCCAAGCCAGCGCGUUUUGCGGACUCGGAUUCCUGAUCGUGCUCGCCCUGUUCCAAGCCGGACUGGGGCGCAUGAUGAUGAAGUACCGCGAUCAGCGGGCAGGAAAGAUCUCCGAGCGGUUGGUGAUCACUUCCGAAAUGAUCGAGAAUAUUCAGUCCGUGAAGGCCUACUGCUGGGAAGAAGCUAUGGAAAAGAUGAUUGAAAACUUGCGGCAAACUGAGCUGAAAUUGACUCGCAAAGCGGCAUACGUCCGCUACUUCAAUAGCAGCGCCUUCUUCUUUUCGGGCUUUUUCGUGGUGUUUCUGAGCGUGCUGCCCUACGCUCUGAUCAAGGGAAUCAUCCUCCGGAAAAUCUUCACCACCAUUUCGUUCUGUAUCGUGUUGCGCAUGGCCGUGACUCGCCAGUUCCCCUGGGCGGUGCAGACCUGGUACGACAGCUUGGGGGCAAUCAAUAAGAUUCAAGACUUCUUGCAAAAGCAGGAGUACAAGACUCUGGAGUACAACCUGACCACCACUGAAGUCGUGAUGGAGAACGUGACCGCCUUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGAAAGCAAAGCAGAAUAACAACAACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAUUCCCUGUUUUUCUCGAACUUCUCCCUGCUCGGAACACCCGUGUUGAAGGACAUCAAUUUCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUCUCGCGGUAGCGGGAAGCACUGGUGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUAUGGGGGAGCUUGAGCCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUAUCUCAUUCUGUAGCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAAGAGAACAUCAUUUUCGGAGUAUCCUAUGAUGAGUACCGAUACAGAUCGGUCAUUAAGGCGUGCCAGUUGGAAGAGGACAUUUCUAAGUUCGCCGAGAAGGAUAACAUCGUCUUGGGAGAAGGGGGUAUUACAUUGUCGGGAGGGCAGCGAGCGCGGAUCAGCCUCGCGAGAGCGGUAUACAAAGAUGCAGAUUUGUAUCUGCUUGAUUCACCGUUUGGAUACCUCGACGUAUUGACAGAAAAAGAAAUCUUCGAGUCGUGCGUGUGUAAACUUAUGGCUAAUAAGACGAGAAUCCUGGUGACUUCCAAAAUGGAGCAUCUCAAGAAGGCGGACAAGAUCCUGAUUCUGCAUGAGGGAUCAAGCUAUUUCUACGGAACUUUUUCCGAGCUGCAGAACCUCCAGCCGGAUUUUAGCUCCAAGCUGAUGGGUUGCGACUCAUUCGACCAAUUCUCGGCUGAGCGGCGGAACUCAAUCCUGACCGAAACCCUGCAUCGCUUCUCCCUUGAGGGAGAUGCCCCGGUGUCGUGGACUGAGACUAAAAAGCAGUCGUUUAAGCAAACUGGCGAAUUCGGCGAAAAGCGGAAGAAUAGCAUCCUCAACCCAAUCAACAGCAUUCGGAAGUUCAGCAUCGUCCAAAAGACCCCGCUCCAGAUGAACGGCAUUGAAGAGGACUCAGACGAGCCAUUGGAAAGACGCCUGUCACUGGUCCCAGAUUCGGAGCAGGGUGAAGCAAUUCUGCCUCGGAUCUCGGUCAUCUCGACUGGCCCCACUCUCCAAGCUCGGCGGAGACAGAGCGUGCUUAACUUGAUGACCCACUCCGUGAACCAGGGUCAGAACAUCCACCGCAAAACCACCGCCUCCACCAGGAAGGUGUCACUGGCCCCUCAAGCCAAUCUGACUGAGUUGGAUAUCUACUCCAGAAGGCUCAGCCAGGAAACCGGACUGGAAAUCUCGGAAGAGAUCAACGAAGAGGAUCUCAAAGAGUGUUUCUUCGACGACAUGGAAUCAAUCCCUGCUGUCACUACUUGGAACACCUAUCUCCGCUACAUUACCGUGCACAAGUCACUCAUCUUCGUCCUGAUCUGGUGCCUCGUGAUCUUCCUGGCCGAGGUCGCAGCAUCGCUGGUCGUGCUGUGGCUGCUCGGCAACACCCCACUCCAAGACAAAGGCAACAGCACCCAUUCCCGCAACAACUCCUACGCGGUGAUCAUCACUUCAACUUCGUCCUACUACGUCUUUUACAUCUACGUGGGCGUGGCGGACACGCUCCUGGCUAUGGGGUUCUUUCGCGGGCUGCCUCUUGUCCACACGCUCAUCACUGUGUCAAAGAUUCUCCACCACAAAAUGCUGCACUCCGUGCUCCAGGCCCCUAUGUCGACUUUGAACACGCUUAAGGCCGGAGGCAUCCUUAACAGAUUCUCGAAAGAUAUCGCGAUCUUGGACGAUCUUCUGCCGCUGACUAUCUUUGACUUCAUCCAACUCCUGCUGAUCGUCAUCGGUGCCAUCGCAGUGGUCGCGGUGCUCCAACCGUACAUUUUCGUGGCGACUGUGCCGGUGAUCGUGGCGUUCAUCAUGCUGCGGGCUUACUUUCUUCAGACCUCACAGCAGCUGAAGCAACUCGAAUCGGAGGGUAGAUCACCAAUCUUUACCCACCUCGUCACCUCGCUGAAGGGACUCUGGACCCUGCGCGCAUUUGGACGGCAACCGUACUUCGAGACUCUCUUCCAUAAGGCCCUGAAUCUGCAUACGGCGAAUUGGUUUCUUUACCUCUCGACGCUCCGCUGGUUCCAGAUGCGCAUUGAGAUGAUUUUCGUCAUCUUUUUCAUCGCGGUGACCUUCAUCUCCAUCCUCACCACGGGUGAGGGAGAGGGCAGAGUCGGAAUUAUCCUCACUCUGGCCAUGAACAUCAUGUCCACUCUGCAGUGGGCCGUCAACUCAUCCAUUGACGUGGACUCGCUGAUGCGCUCCGUGUCGAGAGUGUUCAAGUUCAUCGAUAUGCCGACCGAGGGAAAGCCAACUAAGUCGACCAAGCCGUACAAAAACGGACAGCUGAGCAAGGUCAUGAUCAUCGAAAACUCCCACGUGAAAAAGGAUGACAUCUGGCCGUCCGGUGGACAGAUGACGGUGAAGGAUCUGACUGCGAAGUACACUGAGGGAGGGAAUGCCAUCCUCGAAAACAUCUCAUUCUCAAUCUCCCCUGGACAGAGGGUCGGGCUGCUGGGCCGCACUGGCUCGGGGAAGUCGACUCUUCUUUCGGCAUUUCUGCGCUUGCUCAAUACCGAGGGAGAAAUCCAGAUCGAUGGAGUGUCAUGGGACUCGAUCACCCUGCAGCAGUGGCGCAAGGCUUUUGGCGUCAUCCCGCAAAAGGUGUUCAUCUUCUCGGGCACUUUUAGAAAGAAUCUGGAUCCCUACGAACAGUGGUCAGAUCAAGAGAUUUGGAAAGUCGCAGACGAAGUGGGCCUCCGGUCCGUGAUUGAACAGUUUCCGGGAAAGCUCGACUUCGUGCUUGUGGACGGAGGAUGUGUGCUGAGCCACGGCCACAAACAGCUCAUGUGCCUGGCUCGGUCGGUCCUGUCGAAAGCAAAGAUCCUGCUGCUGGACGAACCGUCGGCACACCUCGAUCCAGUGACGUACCAGAUCAUCCGGCGGACCCUGAAGCAGGCCUUCGCAGACUGCACUGUCAUUUUGUGUGAACACAGAAUCGAAGCUAUGUUGGAGUGCCAGCAGUUCCUGGUCAUCGAAGAAAACAAAGUCCGCCAGUACGAUUCGAUUCAGAAGCUGCUGAACGAACGGAGCCUCUUCAGACAGGCGAUCAGCCCCAGCGAUCGGGUCAAGUUGUUCCCGCAUCGGAACAGCAGCAAGUGUAAGUCAAAGCCUCAGAUCGCUGCACUCAAAGAAGAGACUGAAGAAGAAGUGCAAGACACCAGACUCUGA(配列番号12)

配列番号13
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配列番号14
AUGCAAAGGUCCCCAUUGGAGAAGGCCUCAGUGGUGUCGAAGCUGUUCUUCUCGUGGACCAGGCCUAUCCUCCGGAAGGGAUACAGACAGCGGCUGGAACUGUCCGAUAUCUACCAGAUCCCCAGCGUGGACAGCGCCGAUAAUCUCAGCGAAAAGCUGGAACGGGAAUGGGACCGCGAACUCGCUUCGAAGAAGAACCCGAAGCUGAUUAAUGCUCUGCGGAGAUGUUUCUUUUGGCGGUUCAUGUUUUACGGAAUCUUUCUGUACUUGGGAGAGGUCACGAAGGCUGUGCAGCCUCUGCUGCUGGGACGGAUUAUCGCGUCGUAUGACCCCGACAAUAAGGAAGAACGCAGCAUCGCAAUCUACCUGGGCAUCGGAUUGUGCCUGCUGUUCAUCGUGAGAACUCUCCUGCUGCAUCCAGCCAUCUUCGGACUCCACCACAUUGGAAUGCAGAUGAGAAUCGCAAUGUUCUCCCUGAUCUACAAGAAAACGCUCAAGCUCAGCAGCCGCGUGCUCGAUAAGAUCAGCAUCGGUCAAUUGGUGUCCCUGCUGUCGAAUAACCUCAACAAGUUCGACGAAGGGUUGGCCCUCGCUCACUUCGUGUGGAUCGCACCUCUGCAAGUGGCCCUGCUGAUGGGACUGAUUUGGGAGCUGCUGCAGGCUUCCGCUUUCUGCGGCCUGGGAUUUCUUAUCGUGCUUGCUCUGUUCCAGGCGGGACUGGGACGCAUGAUGAUGAAGUACCGGGACCAACGGGCUGGAAAGAUCAGCGAACGGCUGGUGAUCACUUCCGAAAUGAUUGAGAAUAUCCAGUCAGUCAAGGCGUACUGCUGGGAAGAGGCUAUGGAAAAGAUGAUUGAAAAUCUGAGACAAACCGAGCUGAAGCUGACUCGGAAAGCGGCCUACGUCAGAUACUUCAAUAGCUCAGCUUUCUUUUUCUCGGGGUUUUUCGUCGUGUUCCUGUCGGUGCUUCCCUAUGCCCUGAUUAAGGGCAUCAUUCUGCGCAAGAUCUUCACUACGAUCUCAUUCUGCAUCGUGCUGCGCAUGGCUGUGACCAGACAAUUCCCGUGGGCCGUGCAAACCUGGUACGAUUCACUGGGAGCCAUCAACAAGAUCCAAGACUUUCUCCAAAAACAGGAGUAUAAGACCCUGGAGUACAACCUGACUACUACCGAGGUGGUGAUGGAGAACGUGACUGCGUUUUGGGAAGAAGGGUUCGGCGAACUGUUUGAAAAGGCCAAGCAGAACAAUAACAACAGAAAGACUUCAAACGGAGAUGACUCGCUGUUCUUUUCGAACUUCAGCCUGCUGGGUACCCCAGUGUUGAAAGAUAUCAACUUCAAGAUUGAGAGAGGACAGCUGCUGGCUGUGGCGGGAUCCACCGGAGCAGGAAAAACUUCACUCCUGAUGGUGAUCAUGGGAGAACUCGAACCGUCAGAGGGGAAGAUUAAACACUCGGGAAGAAUCUCAUUUUGCUCCCAAUUUUCAUGGAUUAUGCCGGGAACCAUUAAAGAAAACAUUAUCUUCGGCGUGUCCUACGACGAGUACCGCUACAGAUCGGUGAUCAAAGCAUGCCAGCUGGAAGAGGACAUCUCGAAAUUCGCUGAAAAAGACAAUAUCGUGCUCGGGGAAGGCGGCAUCACCCUCAGCGGAGGACAACGGGCACGGAUUUCGCUCGCACGCGCAGUCUACAAAGACGCCGAUCUCUACCUCUUGGACAGCCCAUUCGGGUAUCUGGACGUGCUCACCGAGAAAGAGAUCUUCGAAAGCUGCGUCUGCAAGCUCAUGGCCAACAAGACCCGCAUCCUCGUGACGUCGAAGAUGGAACAUCUUAAGAAGGCUGACAAGAUUCUCAUUCUCCAUGAAGGGAGCUCAUACUUCUACGGCACCUUUUCCGAGCUCCAGAAUCUGCAACCGGACUUCUCGUCCAAGCUGAUGGGCUGCGAUUCGUUUGAUCAGUUCUCCGCCGAGCGGAGAAACAGCAUUCUGACGGAAACCCUGCACCGGUUCUCGCUGGAAGGCGAUGCACCGGUGUCGUGGACCGAAACUAAGAAGCAAUCGUUCAAGCAGACGGGAGAGUUUGGAGAGAAGCGGAAAAACUCCAUCCUCAACCCGAUCAACAGCAUCCGGAAGUUCAGCAUCGUGCAAAAGACCCCGCUCCAGAUGAAUGGCAUUGAAGAGGACUCCGACGAACCUUUGGAACGCAGACUGAGCCUCGUGCCGGAUUCAGAACAGGGAGAAGCCAUUCUGCCACGGAUCUCCGUGAUCAGCACUGGGCCAACUCUCCAAGCACGGCGGAGGCAGUCCGUGCUGAAUCUUAUGACGCACAGCGUGAACCAAGGGCAGAACAUCCAUAGAAAAACGACCGCUUCGACCAGGAAAGUCUCCCUCGCCCCACAAGCUAACCUCACGGAACUGGAUAUCUACUCCCGCAGACUGUCGCAAGAGACUGGCCUUGAGAUCUCCGAAGAGAUUAACGAAGAAGAUCUCAAAGAAUGUUUCUUCGAUGAUAUGGAAUCAAUCCCGGCAGUGACCACUUGGAACACCUACUUGCGCUAUAUCACUGUGCACAAAAGCCUUAUCUUCGUCCUCAUCUGGUGCCUCGUCAUCUUCCUGGCUGAGGUCGCAGCCUCGCUGGUCGUGCUCUGGUUGCUCGGAAACACUCCGCUGCAGGAUAAGGGGAAUUCGACUCACUCGCGGAACAAUUCGUACGCUGUCAUUAUCACCUCGACGUCGUCAUACUACGUGUUUUACAUCUACGUGGGAGUGGCUGACACUCUGUUGGCUAUGGGGUUCUUUCGCGGCCUGCCACUGGUCCAUACUCUCAUUACUGUGUCCAAAAUCCUUCAUCACAAGAUGUUGCAUUCAGUGCUGCAAGCACCGAUGUCCACCCUCAAUACCCUUAAGGCUGGCGGGAUUCUCAACCGCUUCUCGAAAGACAUCGCCAUCCUCGAUGAUCUUCUGCCUCUCACCAUCUUUGAUUUCAUCCAGCUGCUCCUGAUCGUGAUCGGAGCGAUUGCCGUGGUGGCAGUGUUGCAGCCGUACAUCUUUGUCGCAACUGUGCCGGUCAUCGUCGCCUUCAUCAUGCUGCGCGCCUACUUCUUGCAAACGUCACAGCAACUGAAGCAGCUUGAAUCCGAGGGAAGAUCACCUAUCUUCACCCACCUCGUGACUUCGCUGAAGGGGCUGUGGACGCUGCGCGCAUUUGGAAGGCAACCGUACUUCGAGACUUUGUUCCACAAGGCGCUCAAUCUUCACACUGCCAAUUGGUUCUUGUACCUGUCAACGCUGAGAUGGUUUCAGAUGCGGAUCGAAAUGAUCUUCGUGAUCUUCUUUAUCGCGGUGACUUUCAUCUCGAUCCUGACUACCGGAGAGGGAGAAGGACGGGUGGGUAUUAUCCUCACUCUGGCGAUGAACAUCAUGUCGACGCUUCAGUGGGCGGUGAAUAGCUCAAUCGAUGUCGACUCGCUGAUGCGCUCCGUGAGCCGGGUGUUUAAGUUCAUCGACAUGCCAACUGAAGGGAAGCCGACCAAGUCGACCAAACCGUACAAAAACGGACAGCUCUCCAAGGUGAUGAUUAUCGAGAAUUCCCACGUGAAAAAGGACGACAUCUGGCCAUCCGGUGGACAGAUGACCGUGAAGGACCUGACCGCGAAGUACACUGAGGGAGGCAACGCAAUCCUUGAGAACAUCAGCUUCUCCAUCUCGCCCGGUCAGAGGGUGGGCCUUCUUGGCCGGACCGGAUCGGGAAAGUCCACUCUUCUGUCGGCCUUUCUUCGCCUCUUGAAUACUGAAGGGGAAAUCCAGAUCGACGGAGUGUCGUGGGAUAGCAUCACUCUGCAGCAGUGGCGGAAAGCGUUUGGAGUAAUCCCCCAAAAGGUCUUUAUCUUUAGCGGAACCUUCCGAAAGAAUCUCGAUCCUUAUGAACAGUGGUCAGAUCAAGAGAUUUGGAAAGUCGCGGACGAGGUUGGCCUUCGGAGUGUAAUCGAGCAGUUUCCGGGAAAACUCGACUUUGUCCUUGUAGAUGGGGGAUGCGUCCUGUCGCAUGGGCACAAGCAGCUCAUGUGCCUGGCGCGAUCCGUCCUCUCUAAAGCGAAAAUUCUUCUCUUGGAUGAACCUUCGGCCCAUCUGGACCCGGUAACGUAUCAGAUCAUCAGAAGGACACUUAAGCAGGCGUUUGCCGACUGCACGGUGAUUCUCUGUGAGCAUCGUAUCGAGGCCAUGCUCGAAUGCCAGCAAUUUCUUGUCAUCGAAGAGAAUAAGGUCCGCCAGUACGACUCCAUCCAGAAGCUGCUUAAUGAGAGAUCAUUGUUCCGGCAGGCGAUUUCACCAUCCGAUAGGGUGAAACUUUUUCCACACAGAAAUUCGUCGAAGUGCAAGUCCAAACCGCAGAUCGCGGCCUUGAAAGAAGAGACUGAAGAAGAAGUUCAAGACACGCGUCUUUAA(配列番号14)

配列番号15
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配列番号16
AUGGCCACUGGAUCAAGAACCUCACUGCUGCUCGCUUUUGGACUGCUUUGCCUGCCCUGGUUGCAAGAAGGAUCGGCUUUCCCGACCAUCCCACUCUCCAUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAACUCUUCUUCUCAUGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGACCGCGAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGAGAAGGUGCUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGGGAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCGCCUCGUACGACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUACCUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGUUGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAUCACAUCGGUAUGCAGAUGCGAAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAACUCUCGUCGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCCCUGCUUAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUUUCGUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUAUUUGGGAGCUGUUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUCUGAUUGUGUUGGCAUUGUUUCAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAUGAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAAAUCUCGGAAAGACUCGUCAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCAAAGCCUAUUGCUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCCGCCAAACUGAGCUGAAACUGACCCGCAAGGCGGCGUAUGUCCGGUAUUUCAAUUCGUCAGCGUUCUUCUUUUCCGGGUUCUUCGUUGUCUUUCUCUCGGUUUUGCCUUAUGCCUUGAUUAAGGGGAUUAUCCUCCGCAAGAUUUUCACCACGAUUUCGUUCUGCAUUGUAUUGCGCAUGGCAGUGACACGGCAAUUUCCGUGGGCCGUGCAGACAUGGUAUGACUCGCUUGGAGCGAUCAACAAAAUCCAAGACUUCUUGCAAAAGCAAGAGUACAAGACCCUGGAGUACAAUCUUACUACUACGGAGGUAGUAAUGGAGAAUGUGACGGCUUUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGAAAGCAAAGCAGAAUAACAACAACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAUUCCCUGUUUUUCUCGAACUUCUCCCUGCUCGGAACACCCGUGUUGAAGGACAUCAAUUUCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUCUCGCGGUAGCGGGAAGCACUGGUGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUAUGGGGGAGCUUGAGCCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUAUCUCAUUCUGUAGCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAAGAGAACAUCAUUUUCGGAGUAUCCUAUGAUGAGUACCGAUACAGAUCGGUCAUUAAGGCGUGCCAGUUGGAAGAGGACAUUUCUAAGUUCGCCGAGAAGGAUAACAUCGUCUUGGGAGAAGGGGGUAUUACAUUGUCGGGAGGGCAGCGAGCGCGGAUCAGCCUCGCGAGAGCGGUAUACAAAGAUGCAGAUUUGUAUCUGCUUGAUUCACCGUUUGGAUACCUCGACGUAUUGACAGAAAAAGAAAUCUUCGAGUCGUGCGUGUGUAAACUUAUGGCUAAUAAGACGAGAAUCCUGGUGACAUCAAAAAUGGAACACCUUAAGAAGGCGGACAAGAUCCUGAUCCUCCACGAAGGAUCGUCCUACUUUUACGGCACUUUCUCAGAGUUGCAAAACUUGCAGCCGGACUUCUCAAGCAAACUCAUGGGGUGUGACUCAUUCGACCAGUUCAGCGCGGAACGGCGGAACUCGAUCUUGACGGAAACGCUGCACCGAUUCUCGCUUGAGGGUGAUGCCCCGGUAUCGUGGACCGAGACAAAGAAGCAGUCGUUUAAGCAGACAGGAGAAUUUGGUGAGAAAAGAAAGAACAGUAUCUUGAAUCCUAUUAACUCAAUUCGCAAGUUCUCAAUCGUCCAGAAAACUCCACUGCAGAUGAAUGGAAUUGAAGAGGAUUCGGACGAACCCCUGGAGCGCAGGCUUAGCCUCGUGCCGGAUUCAGAGCAAGGGGAGGCCAUUCUUCCCCGGAUUUCGGUGAUUUCAACCGGACCUACACUUCAGGCGAGGCGAAGGCAAUCCGUGCUCAACCUCAUGACGCAUUCGGUAAACCAGGGGCAAAACAUUCACCGCAAAACGACGGCCUCAACGAGAAAAGUGUCACUUGCACCCCAGGCGAAUUUGACUGAACUCGACAUCUACAGCCGUAGGCUUUCGCAAGAAACCGGACUUGAGAUCAGCGAAGAAAUCAAUGAAGAAGAUUUGAAAGAGUGUUUCUUUGAUGACAUGGAAUCAAUCCCAGCGGUGACAACGUGGAACACAUACUUGCGUUACAUCACGGUGCACAAGUCCUUGAUUUUCGUCCUCAUCUGGUGUCUCGUGAUCUUUCUCGCUGAGGUCGCAGCGUCACUUGUGGUCCUCUGGCUGCUUGGUAAUACGCCCUUGCAAGACAAAGGCAAUUCUACACACUCAAGAAACAAUUCCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCUACAAGCUCGUAUUACGUGUUUUACAUCUACGUAGGAGUGGCCGACACUCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCCGAGGACUCCCACUCGUUCACACGCUUAUCACUGUCUCCAAGAUUCUCCACCAUAAGAUGCUUCAUAGCGUACUGCAGGCUCCCAUGUCCACCUUGAAUACGCUCAAGGCGGGAGGUAUUUUGAAUCGCUUCUCAAAAGAUAUUGCAAUUUUGGAUGACCUUCUGCCCCUGACGAUCUUCGACUUCAUCCAGUUGUUGCUGAUCGUGAUUGGGGCUAUUGCAGUAGUCGCUGUCCUCCAGCCUUACAUUUUUGUCGCGACCGUUCCGGUGAUCGUGGCGUUUAUCAUGCUGCGGGCCUAUUUCUUGCAGACGUCACAGCAGCUUAAGCAACUGGAGUCUGAAGGGAGGUCGCCUAUCUUUACGCAUCUUGUGACCAGUUUGAAGGGAUUGUGGACGUUGCGCGCCUUUGGCAGGCAGCCCUACUUUGAAACACUGUUCCACAAAGCGCUGAAUCUCCAUACGGCAAAUUGGUUUUUGUAUUUGAGUACCCUCCGAUGGUUUCAGAUGCGCAUUGAGAUGAUUUUUGUGAUCUUCUUUAUCGCGGUGACUUUUAUCUCCAUCUUGACCACGGGAGAGGGCGAGGGACGGGUCGGUAUUAUCCUGACACUCGCCAUGAACAUUAUGAGCACUUUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUUGAUGUGGAUAGCCUGAUGAGGUCCGUUUCGAGGGUCUUUAAGUUCAUCGACAUGCCGACGGAGGGAAAGCCCACAAAAAGUACGAAACCCUAUAAGAAUGGGCAAUUGAGUAAGGUAAUGAUCAUCGAGAACAGUCACGUGAAGAAGGAUGACAUCUGGCCUAGCGGGGGUCAGAUGACCGUGAAGGACCUGACGGCAAAAUACACCGAGGGAGGGAACGCAAUCCUUGAAAACAUCUCGUUCAGCAUUAGCCCCGGUCAGCGUGUGGGGUUGCUCGGGAGGACCGGGUCAGGAAAAUCGACGUUGCUGUCGGCCUUCUUGAGACUUCUGAAUACAGAGGGUGAGAUCCAGAUCGACGGCGUUUCGUGGGAUAGCAUCACCUUGCAGCAGUGGCGGAAAGCGUUUGGAGUAAUCCCCCAAAAGGUCUUUAUCUUUAGCGGAACCUUCCGAAAGAAUCUCGAUCCUUAUGAACAGUGGUCAGAUCAAGAGAUUUGGAAAGUCGCGGACGAGGUUGGCCUUCGGAGUGUAAUCGAGCAGUUUCCGGGAAAACUCGACUUUGUCCUUGUAGAUGGGGGAUGCGUCCUGUCGCAUGGGCACAAGCAGCUCAUGUGCCUGGCGCGAUCCGUCCUCUCUAAAGCGAAAAUUCUUCUCUUGGAUGAACCUUCGGCCCAUCUGGACCCGGUAACGUAUCAGAUCAUCAGAAGGACACUUAAGCAGGCGUUUGCCGACUGCACGGUGAUUCUCUGUGAGCAUCGUAUCGAGGCCAUGCUCGAAUGCCAGCAAUUUCUUGUCAUCGAAGAGAAUAAGGUCCGCCAGUACGACUCCAUCCAGAAGCUGCUUAAUGAGAGAUCAUUGUUCCGGCAGGCGAUUUCACCAUCCGAUAGGGUGAAACUUUUUCCACACAGAAAUUCGUCGAAGUGCAAGUCCAAACCGCAGAUCGCGGCCUUGAAAGAAGAGACUGAAGAAGAAGUUCAAGACACGCGUCUUUAA(配列番号16)

配列番号17
AUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAACUCUUCUUCUCAUGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGACCGCGAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGAGAAGGUGCUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGGGAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCGCCUCGUACGACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUACCUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGUUGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAUCACAUCGGUAUGCAGAUGCGAAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAACUCUCGUCGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCCCUGCUUAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUUUCGUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUAUUUGGGAGCUGUUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUCUGAUUGUGUUGGCAUUGUUUCAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAUGAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAAAUCUCGGAAAGACUCGUCAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCAAAGCCUAUUGCUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCCGCCAAACUGAGCUGAAACUGACCCGCAAGGCGGCGUAUGUCCGGUAUUUCAAUUCGUCAGCGUUCUUCUUUUCCGGGUUCUUCGUUGUCUUUCUCUCGGUUUUGCCUUAUGCCUUGAUUAAGGGGAUUAUCCUCCGCAAGAUUUUCACCACGAUUUCGUUCUGCAUUGUAUUGCGCAUGGCAGUGACACGGCAAUUUCCGUGGGCCGUGCAGACAUGGUAUGACUCGCUUGGAGCGAUCAACAAAAUCCAAGACUUCUUGCAAAAGCAAGAGUACAAGACCCUGGAGUACAAUCUUACUACUACGGAGGUAGUAAUGGAGAAUGUGACGGCUUUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGAAAGCAAAGCAGAAUAACAACAACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAUUCCCUGUUUUUCUCGAACUUCUCCCUGCUCGGAACACCCGUGUUGAAGGACAUCAAUUUCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUCUCGCGGUAGCGGGAAGCACUGGUGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUAUGGGGGAGCUUGAGCCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUAUCUCAUUCUGUAGCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAAGAGAACAUCAUUUUCGGAGUAUCCUAUGAUGAGUACCGAUACAGAUCGGUCAUUAAGGCGUGCCAGUUGGAAGAGGACAUUUCUAAGUUCGCCGAGAAGGAUAACAUCGUCUUGGGAGAAGGGGGUAUUACAUUGUCGGGAGGGCAGCGAGCGCGGAUCAGCCUCGCGAGAGCGGUAUACAAAGAUGCAGAUUUGUAUCUGCUUGAUUCACCGUUUGGAUACCUCGACGUAUUGACAGAAAAAGAAAUCUUCGAGUCGUGCGUGUGUAAACUUAUGGCUAAUAAGACGAGAAUCCUGGUGACAUCAAAAAUGGAACACCUUAAGAAGGCGGACAAGAUCCUGAUCCUCCACGAAGGAUCGUCCUACUUUUACGGCACUUUCUCAGAGUUGCAAAACUUGCAGCCGGACUUCUCAAGCAAACUCAUGGGGUGUGACUCAUUCGACCAGUUCAGCGCGGAACGGCGGAACUCGAUCUUGACGGAAACGCUGCACCGAUUCUCGCUUGAGGGUGAUGCCCCGGUAUCGUGGACCGAGACAAAGAAGCAGUCGUUUAAGCAGACAGGAGAAUUUGGUGAGAAAAGAAAGAACAGUAUCUUGAAUCCUAUUAACUCAAUUCGCAAGUUCUCAAUCGUCCAGAAAACUCCACUGCAGAUGAAUGGAAUUGAAGAGGAUUCGGACGAACCCCUGGAGCGCAGGCUUAGCCUCGUGCCGGAUUCAGAGCAAGGGGAGGCCAUUCUUCCCCGGAUUUCGGUGAUUUCAACCGGACCUACACUUCAGGCGAGGCGAAGGCAAUCCGUGCUCAACCUCAUGACGCAUUCGGUAAACCAGGGGCAAAACAUUCACCGCAAAACGACGGCCUCAACGAGAAAAGUGUCACUUGCACCCCAGGCGAAUUUGACUGAACUCGACAUCUACAGCCGUAGGCUUUCGCAAGAAACCGGACUUGAGAUCAGCGAAGAAAUCAAUGAAGAAGAUUUGAAAGAGUGUUUCUUUGAUGACAUGGAAUCAAUCCCAGCGGUGACAACGUGGAACACAUACUUGCGUUACAUCACGGUGCACAAGUCCUUGAUUUUCGUCCUCAUCUGGUGUCUCGUGAUCUUUCUCGCUGAGGUCGCAGCGUCACUUGUGGUCCUCUGGCUGCUUGGUAAUACGCCCUUGCAAGACAAAGGCAAUUCUACACACUCAAGAAACAAUUCCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCUACAAGCUCGUAUUACGUGUUUUACAUCUACGUAGGAGUGGCCGACACUCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCCGAGGACUCCCACUCGUUCACACGCUUAUCACUGUCUCCAAGAUUCUCCACCAUAAGAUGCUUCAUAGCGUACUGCAGGCUCCCAUGUCCACCUUGAAUACGCUCAAGGCGGGAGGUAUUUUGAAUCGCUUCUCAAAAGAUAUUGCAAUUUUGGAUGACCUUCUGCCCCUGACGAUCUUCGACUUCAUCCAGUUGUUGCUGAUCGUGAUUGGGGCUAUUGCAGUAGUCGCUGUCCUCCAGCCUUACAUUUUUGUCGCGACCGUUCCGGUGAUCGUGGCGUUUAUCAUGCUGCGGGCCUAUUUCUUGCAGACGUCACAGCAGCUUAAGCAACUGGAGUCUGAAGGGAGGUCGCCUAUCUUUACGCAUCUUGUGACCAGUUUGAAGGGAUUGUGGACGUUGCGCGCCUUUGGCAGGCAGCCCUACUUUGAAACACUGUUCCACAAAGCGCUGAAUCUCCAUACGGCAAAUUGGUUUUUGUAUUUGAGUACCCUCCGAUGGUUUCAGAUGCGCAUUGAGAUGAUUUUUGUGAUCUUCUUUAUCGCGGUGACUUUUAUCUCCAUCUUGACCACGGGAGAGGGCGAGGGACGGGUCGGUAUUAUCCUGACACUCGCCAUGAACAUUAUGAGCACUUUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUUGAUGUGGAUAGCCUGAUGAGGUCCGUUUCGAGGGUCUUUAAGUUCAUCGACAUGCCGACGGAGGGAAAGCCCACAAAAAGUACGAAACCCUAUAAGAAUGGGCAAUUGAGUAAGGUAAUGAUCAUCGAGAACAGUCACGUGAAGAAGGAUGACAUCUGGCCUAGCGGGGGUCAGAUGACCGUGAAGGACCUGACGGCAAAAUACACCGAGGGAGGGAACGCAAUCCUUGAAAACAUCUCGUUCAGCAUUAGCCCCGGUCAGCGUGUGGGGUUGCUCGGGAGGACCGGGUCAGGAAAAUCGACGUUGCUGUCGGCCUUCUUGAGACUUCUGAAUACAGAGGGUGAGAUCCAGAUCGACGGCGUUUCGUGGGAUAGCAUCACCUUGCAGCAGUGGCGGAAAGCGUUUGGAGUAAUCCCCCAAAAGGUCUUUAUCUUUAGCGGAACCUUCCGAAAGAAUCUCGAUCCUUAUGAACAGUGGUCAGAUCAAGAGAUUUGGAAAGUCGCGGACGAGGUUGGCCUUCGGAGUGUAAUCGAGCAGUUUCCGGGAAAACUCGACUUUGUCCUUGUAGAUGGGGGAUGCGUCCUGUCGCAUGGGCACAAGCAGCUCAUGUGCCUGGCGCGAUCCGUCCUCUCUAAAGCGAAAAUUCUUCUCUUGGAUGAACCUUCGGCCCAUCUGGACCCGGUAACGUAUCAGAUCAUCAGAAGGACACUUAAGCAGGCGUUUGCCGACUGCACGGUGAUUCUCUGUGAGCAUCGUAUCGAGGCCAUGCUCGAAUGCCAGCAAUUUCUUGUCAUCGAAGAGAAUAAGGUCCGCCAGUACGACUCCAUCCAGAAGCUGCUUAAUGAGAGAUCAUUGUUCCGGCAGGCGAUUUCACCAUCCGAUAGGGUGAAACUUUUUCCACACAGAAAUUCGUCGAAGUGCAAGUCCAAACCGCAGAUCGCGGCCUUGAAAGAAGAGACUGAAGAAGAAGUUCAAGACACGCGUCUUUAA(配列番号17)

配列番号18
AUGGCCACUGGAUCAAGAACCUCACUGCUGCUCGCUUUUGGACUGCUUUGCCUGCCCUGGUUGCAAGAAGGAUCGGCUUUCCCGACCAUCCCACUCUCC(配列番号18)

配列番号19
AUGGCAACUGGAUCAAGAACCUCCCUCCUGCUCGCAUUCGGCCUGCUCUGUCUCCCAUGGCUCCAAGAAGGAAGCGCGUUCCCCACUAUCCCCCUCUCG(配列番号19)

配列番号20
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU(配列番号20)

均等物
本明細書は、本明細書中に引用される参考文献の教示を踏まえて最も完全に理解される。本明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供するものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明に包含されることを認識する。本開示において引用されるすべての刊行物及び特許は、参照によりその全体が組み込まれる。参照により組み込まれる材料が本明細書と矛盾するか、または一貫しない場合、本明細書はいかなるかかる材料にも優先する。本明細書におけるいかなる参考文献の引用も、かかる参考文献が本発明の先行技術であることを認めるものではない。
別途指示されない限り、特許請求の範囲を含む、本明細書において使用される成分の量、反応条件などを表すすべての数字は、近似値として理解されるべきであり、本発明によって得ることが求められる所望の特性に依存して変化してよい。最低限、また均等物の原理の適用を特許請求の範囲に制限する試みとしてではなく、各数値パラメータは、有効桁数及び通常の四捨五入手法を踏まえて解釈されるべきである。本明細書における異なる量の有効数字の一連の数の列挙は、より少ない有効数字が与えられた数が、より多くの有効数字が与えられた数と同じ精度を有することを意味するものとして解釈されるべきではない。
「1つの(a)」または「1つの(an)」という単語の使用は、特許請求の範囲及び/または明細書において「含む(comprising)」という用語と併せて使用される場合、「1つの(one)」を意味し得るが、「1つ以上」、「少なくとも1つ」、及び「1つまたは1つよりも多くの」の意味とも一致する。特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替のみに言及することが明確に示されるか、または代替が互いに排他的である場合を除き、「及び/または」を意味するように使用されるが、本開示は、代替及び「及び/または」のみに言及する定義を支持する。
別途指示されない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連のすべての要素に言及すると理解されるべきである。当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または、ほんの日常的な実験を使用して、それらを確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等な任意の方法及び材料が、本発明の実践または試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料がここで説明される。
本明細書において記述される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のみのために提供される。本明細書におけるいかなる内容も、先行する発明によって本発明がかかる刊行物に先立つ資格がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、独立して確認する必要があり得る。
本発明の他の実施形態は、本明細書の考察、及び本明細書に開示される本発明の実践から、当業者に明らかとなるであろう。本明細書及び実施例は、ほんの例示として見なされることが意図され、本発明の真の範囲及び趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示される。
かかる使用及び治療方法のいくつかの実施形態では、インビトロ転写mRNAは、非自然発生的UTRを含むように修飾されたヒトCFTR(配列番号2)をコードする自然発生的または野生型mRNAである。他の実施形態では、インビトロ転写mRNAは、上述の非自然発生的mRNAである。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
(項目1)
哺乳動物の肺における上皮細胞中のCFTR発現の誘導方法であって、
前記方法が、前記哺乳動物の前記肺における前記上皮細胞を組成物と接触させることを含み、
前記組成物が、インビトロ転写mRNAを含む薬学的組成物であり、
前記インビトロ転写mRNAが、配列番号1をコードするコード配列を含む、前記方法。
(項目2)
哺乳動物の標的細胞中のCFTR発現の誘導方法であって、
前記方法が、前記哺乳動物の標的細胞を組成物と接触させることを含み、
前記組成物が、配列番号1のアミノ酸配列をコードするインビトロ転写mRNAを含む、前記方法。
(項目3)
(a)前記インビトロ転写mRNA配列が、配列番号2よりも少ないクリプティックプロモーター(cryptic promoter)の補体を含む、
(b)前記インビトロ転写mRNA配列が、配列番号2よりも少ない直列反復及び/もしくは逆方向反復を含む、
(c)前記コード配列が、配列番号2よりも少ない不利なコドンを含む、かつ/または、
(d)前記コード配列のGC含量が、配列番号2のGC含量よりも低い、項目1または項目2に記載の方法。
(項目4)
コード配列、5’−UTR、及び3’−UTRを含み、前記コード配列が、配列番号1のアミノ酸配列をコードし、前記コード配列が、配列番号3と少なくとも80%同一である、非自然発生的mRNA分子。
(項目5)
コード配列、5’−UTR、及び3’−UTRを含み、前記コード配列が、配列番号1のアミノ酸配列をコードし、前記コード配列が、配列番号2の野生型コード配列と比べて、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%の表1に列記される非野生型塩基を、表1に列記されるコード配列の位置において含む、非自然発生的mRNA分子。
(項目6)
コード配列、5’−UTR、及び3’−UTRを含み、前記コード配列が、配列番号1のアミノ酸配列をコードし、前記コード配列が、配列番号2の前記野生型コード配列と比べて、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%の表2に列記される非野生型塩基を、表2に列記されるコード配列の対応する位置において含む、非自然発生的mRNA分子。
(項目7)
前記コード配列が、配列番号3と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一である、項目4〜6のいずれか1項に記載のmRNA分子。
(項目8)
前記コード配列が配列番号3と同一である、項目4に記載のmRNA分子。
(項目9)
前記5’−UTRが、配列番号4を含む、かつ/または前記3’−UTRが、配列番号5を含む、項目4〜8のいずれか1項に記載のmRNA分子。
(項目10)
少なくとも70、100、120、150、200、または250残基長のポリAテールをさらに含む、項目4〜9のいずれか1項に記載のmRNA分子。
(項目11)
5’キャップをさらに含む、項目4〜10のいずれか1項に記載のmRNA分子。
(項目12)
少なくとも1つの構成ヌクレオチドが、ロックド核酸残基である、項目4〜11のいずれか1項に記載のmRNA分子。
(項目13)
前記mRNAが、少なくとも1つの非標準核酸塩基を含む、項目4〜12のいずれか1項に記載のmRNA分子。
(項目14)
前記非標準核酸塩基が、5−メチル−シチジン、プソイドウリジン、及び2−チオ−ウリジンのうちの1つ以上から選択される、項目13に記載のmRNA分子。
(項目15)
哺乳動物または哺乳動物の細胞における機能的CFTR発現を誘導するのに使用するための、項目4〜14のいずれか1項に記載のmRNA分子。
(項目16)
項目4〜15のいずれか1項に記載のmRNAの前記配列に相補的な配列を含む、ポリヌクレオチド。
(項目17)
前記ポリヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド残基を含む線状または環状のポリヌクレオチドである、項目16に記載のポリヌクレオチド。
(項目18)
項目16または項目17に記載のポリヌクレオチド、RNAポリメラーゼ、及びヌクレオシド三リン酸塩を含む、組成物。
(項目19)
項目4〜15のいずれか1項に記載のmRNAを含む、薬学的組成物。
(項目20)
ポリエチレンイミン(PEI)、プロタミン、PEG化プロタミン、PLL、PEG化PLL、またはカチオン性脂質から選択される有機カチオンをさらに含み、前記有機カチオンが、前記mRNAと非共有結合的に複合される、項目19に記載の薬学的組成物。
(項目21)
前記有機カチオンがカチオン性脂質であり、前記組成物が、中性脂質、PEG化脂質、及び/またはコレステロールをさらに含む、項目20に記載の薬学的組成物。
(項目22)
前記カチオン性脂質が、DODAP(1,2−ジオレイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン)、DLinDMA、DLin−KC2−DMA、C12−200、HGT4003、HGT5000、HGT5001、MC3、ICE、ジアルキルアミノ部分を含むカチオン性脂質、イミダゾール部分を含むカチオン性脂質、及びグアニジウム部分を含むカチオン性脂質から選択される、項目21に記載の薬学的組成物。
(項目23)
前記中性脂質が、前記組成物中に存在し、かつ、DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、及びDOPG(,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール))から選択される、項目21または22のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目24)
前記PEG化脂質が、前記組成物中に存在し、かつ、長さが最大5kDaのポリ(エチレン)グリコール鎖に共有結合された、C〜C20長の1つ以上のアルキル鎖(複数可)を含む、項目21〜23のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目25)
前記有機カチオンが、10kDa〜40kDaの範囲の分子量を有する分岐状PEIである、項目20に記載の薬学的組成物。
(項目26)
項目19〜25のいずれか1項に記載の薬学的組成物が装填された、噴霧またはエアロゾル化装置。
(項目27)
項目4〜15のいずれか1項に記載のmRNAと、前記mRNAから発現される機能的CFTRと、を含む、培養細胞。
(項目28)
野生型ヒトCFTRをコードするゲノムDNAまたは野生型ヒトCFTRをコードするcDNAを含まない、項目27に記載の培養細胞。
(項目29)
機能的CFTRの発現の誘導のための、項目19〜25のいずれか1項に記載の薬学的組成物の使用。
(項目30)
哺乳動物の肺における上皮細胞中のCFTR発現の誘導方法であって、
前記方法が、前記上皮細胞を組成物と接触させることを含み、
前記組成物が、項目4〜15のいずれか1項に記載のmRNAを含む薬学的組成物である、前記方法。
(項目31)
哺乳動物の標的細胞中のCFTR発現の誘導方法であって、
前記方法が、前記哺乳動物の標的細胞を組成物と接触させることを含み、
前記組成物が、項目4〜15のいずれか1項に記載のmRNAを含む、前記方法。
(項目32)
前記組成物が、ポリエチレンイミン(PEI)またはカチオン性脂質から選択される有機カチオンをさらに含み、前記有機カチオンが、前記インビトロ転写mRNAと非共有結合的に複合される、項目1〜3または29〜31のいずれか1項に記載の方法。
(項目33)
前記組成物が粘液溶解剤を含まない、項目1〜3または29〜32のいずれか1項に記載の方法。
(項目34)
前記有機カチオンがカチオン性脂質であり、前記組成物が、中性脂質、PEG化脂質、及び/またはコレステロールをさらに含む、項目1〜3または29〜33のいずれか1項に記載の方法。
(項目35)
前記カチオン性脂質が、DOTAP(1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DODAP(1,2−ジオレイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン)、DOTMA(1,2−ジ−O−オクタデセニル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DLinDMA、DLin−KC2−DMA、C12−200、HGT4003、HGT5000、HGT5001、MC3、ICE、ジアルキルアミノ部分を含むカチオン性脂質、イミダゾール部分を含むカチオン性脂質、及びグアニジウム部分を含むカチオン性脂質から選択される、項目1〜3または29〜34のいずれか1項に記載の方法。
(項目36)
前記中性脂質が、前記組成物中に存在し、かつ、DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、及びDOPG(,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール))から選択される、項目1〜3または29〜35のいずれか1項に記載の方法。
(項目37)
前記PEG化脂質が、前記組成物中に存在し、かつ、長さが最大5kDaのポリ(エチレン)グリコール鎖に共有結合された、C〜C20長の1つ以上のアルキル鎖(複数可)を含む、項目1〜3または29〜36のいずれか1項に記載の方法。
(項目38)
前記有機カチオンが、10kDa〜40kDaの範囲の分子量を有する分岐状PEIである、項目1〜3または29〜37のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
前記組成物が、噴霧またはエアロゾル化を介して投与される、項目1〜3または29〜38のいずれか1項に記載の方法。
(項目40)
インビトロのCFTR mRNAの作製方法であって、ヌクレオシド三リン酸塩の存在下で、単離ポリヌクレオチドをRNAポリメラーゼと接触させることを含み、
前記単離ポリヌクレオチド及びRNAポリメラーゼが、細胞中に含有されず、
前記単離ポリヌクレオチドが、前記RNAポリメラーゼのための鋳型であり、
前記単離ポリヌクレオチドが、鋳型配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、
前記鋳型配列が、配列番号1をコードする配列に相補的であるコード配列補体を含み、
(a)前記鋳型配列が、配列番号2の補体よりも少ないクリプティックプロモーターを含むか、(b)前記鋳型配列が、配列番号2よりも少ない直列反復及び/もしくは逆方向反復を含むか、(c)前記鋳型配列が、配列番号2よりも少ない不利なコドンの補体を含むか、または(d)前記コード配列補体のGC含量が、配列番号2のGC含量よりも低い、前記方法。
(項目41)
インビトロのCFTR mRNAの作製方法であって、ヌクレオシド三リン酸塩の存在下で、項目16または17のいずれか1項に記載の単離ポリヌクレオチドをRNAポリメラーゼと接触させることを含み、
前記単離ポリヌクレオチド及びRNAポリメラーゼが、細胞中に含有されず、
前記単離ポリヌクレオチドが、前記RNAポリメラーゼのための鋳型であり、
前記単離ポリヌクレオチドが、鋳型配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、
前記RNAポリメラーゼが、配列番号1をコードするコード配列を含むmRNAを合成する、前記方法。
(項目42)
前記RNAポリメラーゼがT7 RNAポリメラーゼである、項目40または41のいずれか1項に記載の方法。
(項目43)
前記ヌクレオシド三リン酸塩が、プソイドウリジン三リン酸塩、5−メチル−シチジン三リン酸塩、及び2−チオ−ウリジン三リン酸塩のうちの1つ以上を含む、項目40〜42のいずれか1項に記載の方法。
(項目44)
配列番号1をコードするコード配列を含む前記mRNAを単離することをさらに含む、項目40〜43のいずれか1項に記載の方法。
(項目45)
5’キャップを前記単離mRNAに付加することをさらに含む、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記キャップ形成された単離mRNAを、1つ以上の有機カチオンを含む1つ以上の薬学的に許容される担体と接触させることによって、薬学的組成物を製剤化することをさらに含む、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記1つ以上の有機カチオンが、ポリエチレンイミン(PEI)、プロタミン、PEG化プロタミン、PLL、PEG化PLL、またはカチオン性脂質を含む、項目46に記載の方法。



  1. 哺乳動物の肺における上皮細胞中のCFTR発現の誘導方法であって、
    前記方法が、前記哺乳動物の前記肺における前記上皮細胞を組成物と接触させることを含み、
    前記組成物が、インビトロ転写mRNAを含む薬学的組成物であり、
    前記インビトロ転写mRNAが、配列番号1をコードするコード配列を含む、前記方法。

  2. 哺乳動物の標的細胞中のCFTR発現の誘導方法であって、
    前記方法が、前記哺乳動物の標的細胞を組成物と接触させることを含み、
    前記組成物が、配列番号1のアミノ酸配列をコードするインビトロ転写mRNAを含む、前記方法。

  3. (a)前記インビトロ転写mRNA配列が、配列番号2よりも少ないクリプティックプロモーター(cryptic promoter)の補体を含む、
    (b)前記インビトロ転写mRNA配列が、配列番号2よりも少ない直列反復及び/もしくは逆方向反復を含む、
    (c)前記コード配列が、配列番号2よりも少ない不利なコドンを含む、かつ/または、
    (d)前記コード配列のGC含量が、配列番号2のGC含量よりも低い、請求項1または請求項2に記載の方法。

  4. コード配列、5’−UTR、及び3’−UTRを含み、前記コード配列が、配列番号1のアミノ酸配列をコードし、前記コード配列が、配列番号3と少なくとも80%同一である、非自然発生的mRNA分子。

  5. コード配列、5’−UTR、及び3’−UTRを含み、前記コード配列が、配列番号1のアミノ酸配列をコードし、前記コード配列が、配列番号2の野生型コード配列と比べて、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%の表1に列記される非野生型塩基を、表1に列記されるコード配列の位置において含む、非自然発生的mRNA分子。

  6. コード配列、5’−UTR、及び3’−UTRを含み、前記コード配列が、配列番号1のアミノ酸配列をコードし、前記コード配列が、配列番号2の前記野生型コード配列と比べて、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%の表2に列記される非野生型塩基を、表2に列記されるコード配列の対応する位置において含む、非自然発生的mRNA分子。

  7. 前記コード配列が、配列番号3と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一である、請求項4〜6のいずれか1項に記載のmRNA分子。

  8. 前記コード配列が配列番号3と同一である、請求項4に記載のmRNA分子。

  9. 前記5’−UTRが、配列番号4を含む、かつ/または前記3’−UTRが、配列番号5を含む、請求項4〜8のいずれか1項に記載のmRNA分子。

  10. 少なくとも70、100、120、150、200、または250残基長のポリAテールをさらに含む、請求項4〜9のいずれか1項に記載のmRNA分子。

  11. 5’キャップをさらに含む、請求項4〜10のいずれか1項に記載のmRNA分子。

  12. 少なくとも1つの構成ヌクレオチドが、ロックド核酸残基である、請求項4〜11のいずれか1項に記載のmRNA分子。

  13. 前記mRNAが、少なくとも1つの非標準核酸塩基を含む、請求項4〜12のいずれか1項に記載のmRNA分子。

  14. 前記非標準核酸塩基が、5−メチル−シチジン、プソイドウリジン、及び2−チオ−ウリジンのうちの1つ以上から選択される、請求項13に記載のmRNA分子。

  15. 哺乳動物または哺乳動物の細胞における機能的CFTR発現を誘導するのに使用するための、請求項4〜14のいずれか1項に記載のmRNA分子。

  16. 請求項4〜15のいずれか1項に記載のmRNAの前記配列に相補的な配列を含む、ポリヌクレオチド。

  17. 前記ポリヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド残基を含む線状または環状のポリヌクレオチドである、請求項16に記載のポリヌクレオチド。

  18. 請求項16または請求項17に記載のポリヌクレオチド、RNAポリメラーゼ、及びヌクレオシド三リン酸塩を含む、組成物。

  19. 請求項4〜15のいずれか1項に記載のmRNAを含む、薬学的組成物。

  20. ポリエチレンイミン(PEI)、プロタミン、PEG化プロタミン、PLL、PEG化PLL、またはカチオン性脂質から選択される有機カチオンをさらに含み、前記有機カチオンが、前記mRNAと非共有結合的に複合される、請求項19に記載の薬学的組成物。

  21. 前記有機カチオンがカチオン性脂質であり、前記組成物が、中性脂質、PEG化脂質、及び/またはコレステロールをさらに含む、請求項20に記載の薬学的組成物。

  22. 前記カチオン性脂質が、DODAP(1,2−ジオレイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン)、DLinDMA、DLin−KC2−DMA、C12−200、HGT4003、HGT5000、HGT5001、MC3、ICE、ジアルキルアミノ部分を含むカチオン性脂質、イミダゾール部分を含むカチオン性脂質、及びグアニジウム部分を含むカチオン性脂質から選択される、請求項21に記載の薬学的組成物。

  23. 前記中性脂質が、前記組成物中に存在し、かつ、DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、及びDOPG(,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール))から選択される、請求項21または22のいずれか1項に記載の薬学的組成物。

  24. 前記PEG化脂質が、前記組成物中に存在し、かつ、長さが最大5kDaのポリ(エチレン)グリコール鎖に共有結合された、C〜C20長の1つ以上のアルキル鎖(複数可)を含む、請求項21〜23のいずれか1項に記載の薬学的組成物。

  25. 前記有機カチオンが、10kDa〜40kDaの範囲の分子量を有する分岐状PEIである、請求項20に記載の薬学的組成物。

  26. 請求項19〜25のいずれか1項に記載の薬学的組成物が装填された、噴霧またはエアロゾル化装置。

  27. 請求項4〜15のいずれか1項に記載のmRNAと、前記mRNAから発現される機能的CFTRと、を含む、培養細胞。

  28. 野生型ヒトCFTRをコードするゲノムDNAまたは野生型ヒトCFTRをコードするcDNAを含まない、請求項27に記載の培養細胞。

  29. 機能的CFTRの発現の誘導のための、請求項19〜25のいずれか1項に記載の薬学的組成物の使用。

  30. 哺乳動物の肺における上皮細胞中のCFTR発現の誘導方法であって、
    前記方法が、前記上皮細胞を組成物と接触させることを含み、
    前記組成物が、請求項4〜15のいずれか1項に記載のmRNAを含む薬学的組成物である、前記方法。

  31. 哺乳動物の標的細胞中のCFTR発現の誘導方法であって、
    前記方法が、前記哺乳動物の標的細胞を組成物と接触させることを含み、
    前記組成物が、請求項4〜15のいずれか1項に記載のmRNAを含む、前記方法。

  32. 前記組成物が、ポリエチレンイミン(PEI)またはカチオン性脂質から選択される有機カチオンをさらに含み、前記有機カチオンが、前記インビトロ転写mRNAと非共有結合的に複合される、請求項1〜3または29〜31のいずれか1項に記載の方法。

  33. 前記組成物が粘液溶解剤を含まない、請求項1〜3または29〜32のいずれか1項に記載の方法。

  34. 前記有機カチオンがカチオン性脂質であり、前記組成物が、中性脂質、PEG化脂質、及び/またはコレステロールをさらに含む、請求項1〜3または29〜33のいずれか1項に記載の方法。

  35. 前記カチオン性脂質が、DOTAP(1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DODAP(1,2−ジオレイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン)、DOTMA(1,2−ジ−O−オクタデセニル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DLinDMA、DLin−KC2−DMA、C12−200、HGT4003、HGT5000、HGT5001、MC3、ICE、ジアルキルアミノ部分を含むカチオン性脂質、イミダゾール部分を含むカチオン性脂質、及びグアニジウム部分を含むカチオン性脂質から選択される、請求項1〜3または29〜34のいずれか1項に記載の方法。

  36. 前記中性脂質が、前記組成物中に存在し、かつ、DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、及びDOPG(,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール))から選択される、請求項1〜3または29〜35のいずれか1項に記載の方法。

  37. 前記PEG化脂質が、前記組成物中に存在し、かつ、長さが最大5kDaのポリ(エチレン)グリコール鎖に共有結合された、C〜C20長の1つ以上のアルキル鎖(複数可)を含む、請求項1〜3または29〜36のいずれか1項に記載の方法。

  38. 前記有機カチオンが、10kDa〜40kDaの範囲の分子量を有する分岐状PEIである、請求項1〜3または29〜37のいずれか1項に記載の方法。

  39. 前記組成物が、噴霧またはエアロゾル化を介して投与される、請求項1〜3または29〜38のいずれか1項に記載の方法。

  40. インビトロのCFTR mRNAの作製方法であって、ヌクレオシド三リン酸塩の存在下で、単離ポリヌクレオチドをRNAポリメラーゼと接触させることを含み、
    前記単離ポリヌクレオチド及びRNAポリメラーゼが、細胞中に含有されず、
    前記単離ポリヌクレオチドが、前記RNAポリメラーゼのための鋳型であり、
    前記単離ポリヌクレオチドが、鋳型配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、
    前記鋳型配列が、配列番号1をコードする配列に相補的であるコード配列補体を含み、
    (a)前記鋳型配列が、配列番号2の補体よりも少ないクリプティックプロモーターを含むか、(b)前記鋳型配列が、配列番号2よりも少ない直列反復及び/もしくは逆方向反復を含むか、(c)前記鋳型配列が、配列番号2よりも少ない不利なコドンの補体を含むか、または(d)前記コード配列補体のGC含量が、配列番号2のGC含量よりも低い、前記方法。

  41. インビトロのCFTR mRNAの作製方法であって、ヌクレオシド三リン酸塩の存在下で、請求項16または17のいずれか1項に記載の単離ポリヌクレオチドをRNAポリメラーゼと接触させることを含み、
    前記単離ポリヌクレオチド及びRNAポリメラーゼが、細胞中に含有されず、
    前記単離ポリヌクレオチドが、前記RNAポリメラーゼのための鋳型であり、
    前記単離ポリヌクレオチドが、鋳型配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、
    前記RNAポリメラーゼが、配列番号1をコードするコード配列を含むmRNAを合成する、前記方法。

  42. 前記RNAポリメラーゼがT7 RNAポリメラーゼである、請求項40または41のいずれか1項に記載の方法。

  43. 前記ヌクレオシド三リン酸塩が、プソイドウリジン三リン酸塩、5−メチル−シチジン三リン酸塩、及び2−チオ−ウリジン三リン酸塩のうちの1つ以上を含む、請求項40〜42のいずれか1項に記載の方法。

  44. 配列番号1をコードするコード配列を含む前記mRNAを単離することをさらに含む、請求項40〜43のいずれか1項に記載の方法。

  45. 5’キャップを前記単離mRNAに付加することをさらに含む、請求項44に記載の方法。

  46. 前記キャップ形成された単離mRNAを、1つ以上の有機カチオンを含む1つ以上の薬学的に許容される担体と接触させることによって、薬学的組成物を製剤化することをさらに含む、請求項45に記載の方法。

  47. 前記1つ以上の有機カチオンが、ポリエチレンイミン(PEI)、プロタミン、PEG化プロタミン、PLL、PEG化PLL、またはカチオン性脂質を含む、請求項46に記載の方法。

 

 

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【解決手段】500nm未満の脱アセチル化ポリ−N−アセチルグルコサミン乳酸塩誘導体ナノ粒子、および核酸を含有しているp−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物。ナノ粒子が、5〜500nmであり、ポリ−N−アセチルグルコサミンの少なくとも40%、好ましくは65%が脱アセチル化しており、乳酸を用いて可溶化されている組成物。また、被験体に核酸を投与する方法であり、例えば、該p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物を該被験体の皮下に投与する等の該被験体にp−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物を投与する工程を含む方法。
【選択図】なし
【課題】本発明の目的は、一般的な治療での使用に適した、改善された脂質−治療用核酸組成物であって、核酸を高効率に封入し、薬物:脂質の比率が高く、封入核酸を血清中における分解および浄化から保護し、全身送達に適しており、封入核酸の細胞内送達をもたらすことができ、更には、十分に耐性があり、かつ、有効量の核酸による患者の治療が、患者に対する有意な毒性および/またはリスクを伴わないように、十分な治療指数をもたらすことができる脂質−治療用核酸組成物を提供することである。
【解決手段】本発明の目的が、脂質部分(例えば疎水性鎖)の中心部分または遠位部分に位置する1つ以上の生分解性基を有するカチオン性脂質を、核酸(例えばsiRNA)のような活性剤を送達するための脂質粒子に組み込むことによって、達成されることを見出した。
【選択図】なし
【課題】治療、診断等に有用なRNA干渉誘導剤等の薬物の細胞内送達及び細胞、組織、器官等へのインビボ送達を改善するための新規な化合物、及びそれを含有する組成物、処方物の提供。
【解決手段】下式で示される化合物及びその塩。R−(C=O)−Xaa−Z−R[Xaaはノル−ノルアルギニン又はホモアルギニン;R、Rは、夫々独立して、置換若しくは非置換のC12−22アルキル基又はC12−22アルケニル基;Zは、NH]
【選択図】なし
【課題】オリゴヌクレオチドを有する脂質ナノ粒子を形成するためのコレステロールおよびPEG−脂質などの他の脂質成分と組み合わせて使用され得る新規なカチオン性脂質及び肝臓内低脂質レベルの結果向上した有効性とともに低肝臓毒性を示すカチオン性脂質骨格の提供。
【解決手段】式Aで表されるカチオン性脂質又はその任意の薬学的に許容され得る塩或いは立体異性体。


(R1及びR2はH、C1〜C6アルキル、ヘテロシクリル又はポリアミン等;R3はH、C1〜C6アルキル等;R’はハロゲン、R”、OR”、SR”、CN、CO2R”又はCON(R”)2;R”はH又はハロゲン及びOHで置換/非置換のC1〜C6アルキル;nは0〜5の整数;L1はC4〜C24アルキル又はC4〜C24アルケニル;L2はC3〜C9アルキル又はC3〜C9アルケニル)
【選択図】図1
【課題】核酸およびタンパク質の送達のためのプラットフォームを提供すること。【解決手段】(a)パッケージングモーターをキャリアに付着させる工程、および(b)外来物質を該キャリアの内部コンパートメント内に転移させ、それによってパッケージングマシンを形成させる工程を含み、ペプチド様成分が該キャリアの外表面に結合される、方法が開示される。【選択図】図1
【課題】RNA干渉及びその他の治療方法に使用するための様々なペプチド−RNA化合物及び組成物の提供。【解決手段】直径1000nm未満の縮合粒子を含む化合物であって、ここでその粒子が1又はそれ以上の二本鎖リボ核酸(dsKNA)及び1又はそれ以上のペプチドを含む化合物、組成物、及び方法。さらに詳細には、RNAiを通して標的遺伝子の発現を阻害する活性を有する、RNAとペプチドとが縮合した安定な小粒子を含有する化合物。【選択図】図10
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