Tale転写活性化因子

 

TALE−活性化因子結合部位を同定するコンピュータプログラム、アルゴリズムおよび方法、ならびに前記部位と結合するTALE−活性化因子の生成方法およびその使用。

 

 

優先権主張
本出願は2013年2月7日に出願された米国仮特許出願第61/762,125号の利益を主張するものである。前述の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府の助成を受けた研究または開発
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された補助金番号DP1 OD006862、P50 HG005550、R01 NS073124およびT32 CA009216の下での政府支援により行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、人工のTALエフェクター活性化因子(TALE−活性化因子)を設計および改変するための方法、例えば、コンピュータ実装方法に関する。
キサントモナス属(Xanthomonas)由来の転写活性化因子様(TAL)エフェクター技術の急速な進歩で、遺伝子配列または発現の標的改変のためのツールを、研究者は誰でも構築することができるようになった。高度に保存された33〜35個のアミノ酸のTALエフェクター反復ドメインの各々は、2個の高頻度可変性残基の識別性によって規定された特異性で、DNAの1つのヌクレオチドに結合する。特異的なDNA配列を認識することができるタンパク質を構築するために、異なる特異性を有する反復を、単純に多量体化アレイに結合する。最近の成果の多くは、改変されたTALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、つまりTALエフェクター反復アレイと、さまざまな異なる生物と細胞型における内在性遺伝子の日常的な標的改変を可能にするヌクレアーゼドメインとからなる融合物に集中している。植物およびヒトの細胞で内在性遺伝子発現を増加させることができる人工のTALエフェクター活性化因子(TALE−活性化因子)を構築するために、TALエフェクター反復アレイは、転写活性化ドメインにも融合されている。2−10対象の標的遺伝子用にカスタムメイドすることができる人工の転写因子は、広く有用な研究ツールとしての将来性をすでに示して、治療的な応用への可能性がある。11
少なくとも一部には、本発明は、16.5〜22.5の反復からなるTALE−活性化因子は最適活性を持つという発見、およびTALE−活性化因子によって誘導される遺伝子発現レベルは、使用する特異的な活性化ドメインを変えることによって、および/またはTALE−活性化因子の能力を利用することによって、天然に存在する転写因子のように、相乗的に機能するために微調整することができるという発見に基づく。
したがって第1の態様において、本発明は、1つまたは複数の処理装置によって実行されるコンピュータ実装方法を提供する。この方法は、ユーザ装置に、標的遺伝子に関連した情報を受け取るためのユーザ入力機構を含むユーザインタフェースを表示させる情報を提供するステップと、ユーザ装置から、選択された標的遺伝子を受け取るステップと、1つまたは複数のコンピュータによって、標的遺伝子配列の1つまたは複数の部分配列を同定するステップであって、部分配列は、標的遺伝子の制御領域内、例えばプロモーター領域にあり、部分配列は、標的遺伝子の制御領域のDNaseI高感受性領域内にあり、部分配列は、18〜24個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、前記部分配列の1番目のヌクレオチド(1番目の標準的TALE−反復ドメインが結合するヌクレオチドの5’側にある)はチミンであるステップと、1つまたは複数の部分配列を選択するステップと、ユーザ装置に、選択された1つまたは複数の部分配列の少なくとも一部を表示させる情報を提供するステップとを含む。
別の態様において、本発明はキサントモナス属(Xanthomonas)由来の転写活性化因子様エフェクター(TALE)活性化因子結合部位の候補を同定する方法を提供する。この方法は、標的遺伝子を選択するステップと、標的遺伝子配列の1つまたは複数の部分配列を同定するステップであって、部分配列は、標的遺伝子の制御領域内、例えばプロモーター領域内にあり、部分配列は、標的遺伝子の制御領域のDNaseI高感受性領域内にあり、部分配列は、18〜24個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、部分配列の1番目のヌクレオチド(すなわち、1番目の標準的TALE−反復ドメインが結合するヌクレオチドの5’側にある)はチミンであるステップと、TALE−活性化因子結合部位の候補として、1つまたは複数の部分配列を選択するステップとを含む。
部分配列の選択は、標的遺伝子の制御領域内、例えば、プロモーター領域内で部分配列の存在に基づき、標的遺伝子の制御領域のDNaseI高感受性領域内で、部分配列の存在に基づき、18〜24個のヌクレオチドの長さの部分配列を選択すること、および任意選択で、部分配列の中の1番目のヌクレオチドのすぐ5’側にヌクレオチドとしてチミンを持つ配列を選択することが行われた。
いくつかの実施形態において、方法には、以下の1つまたは複数が真であるか、または真ではない部分配列を同定することを含めることができる:部分配列の2番目のヌクレオチドはアデノシンである;部分配列の最も3’側のヌクレオチドはチミンではない;および/または、TALエフェクター反復アレイ結合部位の塩基組成は、天然に存在する結合部位の観察された成分パーセントと2標準偏差を超えて異なる、すなわち、A=0〜63%、C=11〜63%、G=0〜25%、T=2〜42%以外である。
さらなる態様において、本発明は、標的遺伝子、例えばコーディング遺伝子、または非コーディング遺伝子、例えばmiRNAの転写を増加するTALE−活性化因子を作製するための方法を提供する。方法は、標的遺伝子を選択するステップと、標的遺伝子配列の1つまたは複数の部分配列を同定するステップであって、部分配列は、標的遺伝子の制御領域内、例えばプロモーター領域内にあり、部分配列は、標的遺伝子の制御領域のDNaseI高感受性領域内にあり、部分配列は、18〜24個のヌクレオチドの長さで、好ましくは18個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、部分配列の1番目のヌクレオチド(1番目の標準的TALE−反復ドメインが結合するヌクレオチドの5’側にある)はチミンであるステップと、部分配列を選択するステップと、改変された転写活性化因子様エフェクター(TALE)反復アレイを含み、選択された部分配列と特異的に結合する、改変されたDNA結合ドメインと、標的遺伝子の転写を増加させる配列を含むトランス活性化ドメインとを含む融合タンパク質を生成するステップとを含み、それによって、標的遺伝子の転写を増加させるTALE−活性化因子を作製する。
いくつかの実施形態において、TALE反復アレイは、16.5〜22.5反復である(C末端反復は一般的により短く、「ハーフリピート」と呼ばれる)。
いくつかの実施形態において、トランス活性化ドメインはVP16、VP64またはNF−KB p65ドメイン、好ましくはVP64を含む。
さらなる態様において、本発明は、細胞内で標的配列の転写を増加させる方法であって、細胞を、本明細書に記載の方法によって作製されたTALE−活性化因子に接触させることを含む方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、細胞を、本明細書に記載の方法によって作製された2つ以上のTALE−活性化因子に接触させることにより、細胞内で標的配列の転写を増加させる方法を提供する。
いくつかの実施形態において、2つ以上のTALE−活性化因子のうちの少なくとも1つがVP64を含み、2つ以上のTALE−活性化因子のうちの少なくとも1つがNF−KB p65ドメインを含む。
本明細書に記載の方法によって同定された部分配列は、TALE−活性化因子結合部位とも呼ばれる。
部分配列の1番目(5’)のヌクレオチドがチミンである本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、部分配列は、各々が単一の標準的TALE−反復ドメインによって特定されるDNA塩基(例えば、17〜23塩基)と、最もアミノ末端側にある標準的TALE−反復ドメインが接触する1番目の塩基のすぐ5’側に位置する追加のT塩基とを含み、このT塩基は部分配列(すなわち、部分配列は5’Tを含む)の一部であるが、好ましい実施形態で標準的TALE反復ドメインのうちの1つが結合していない(5’Tは、1番目の標準的TALE−反復ドメインより先行するTALEのN末端と接触すると考えられている。このTと接触すると考えられている偽の反復様ドメインが存在する)。例えば、Joung and Sander, Nature Reviews Molecular Cell Biology 14, 49-55 (2013)を参照されたい。5’ヌクレオチドがチミン以外であるいくつかの実施形態において、部分配列は17〜23個のヌクレオチドの長さとすることができ、いくつかの実施形態では、17〜18個のヌクレオチドの長さであり、したがってTALE反復ドメインと接触するヌクレオチドからすべてなる。
定義しない限り、本明細書で使用するすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同義である。方法と材料は、本発明で使用するために本明細書に記載され、当技術分野で知られた、他の、適した方法および材料も使用することができる。材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定する意図はない。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース登録、およびその他の参考文献は、それらの内容全体を参照によって組み込まれるものとする。競合する場合には、定義を含めた本明細書が優先されよう。
本発明の他の特徴および利点は、次の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲より明らかになるであろう。
内在性のヒトVEGF−A遺伝子を標的とする、54個の可変長TALE−活性化因子の活性を示す図である。(a)ヒトVEGF−Aプロモーター領域を表す概略図。転写開始点を黒矢印で示し、以前に公表したDNaseI高感受性領域19を灰色のバーで示す。転写開始部位と比較して+400から+650の地点の間に位置するDNaseI高感受性領域を拡大し、各々のセットにおいて最長のTALE−活性化因子(24.5TALエフェクター反復を含む)が結合した26bpの部位の位置と向きを赤矢印で示す。各々のTALE−活性化因子は3回検定し、エラーバーは平均値の標準誤差を表す。星印は、同一セットの他の値と比較して異常値(正規分布と仮定して)の活性化倍数値を示す。試験したすべての活性化因子(セット7から14.5反復活性化因子を除く)は、片側の、対応があるt検定で測定した場合、1より有意に大きい値まで、VEGF−A発現の活性化倍数値を誘導した。 内在性のヒトVEGF−A遺伝子を標的とする、54個の可変長TALE−活性化因子の活性を示す図である。(b)54個の可変長TALE−活性化因子による293細胞におけるVEGF−Aタンパク質発現の活性化。活性化倍数値は、方法に記載されているように計算した。各々のTALE−活性化因子は3回検定し、エラーバーは平均値の標準誤差を表す。星印は、同一セットの他の値と比較して異常値(正規分布と仮定して)の活性化倍数値を示す。試験したすべての活性化因子(セット7から14.5反復活性化因子を除く)は、片側の、対応があるt検定で測定した場合、1より有意に大きい値まで、VEGF−A発現の活性化倍数値を誘導した。 本研究で用いたTALE−活性化因子構造の概略図である。本発明者らが実験のために用いたTALE−活性化因子構造は、Rebarと同僚ら(Miller, J.C. et al. Nat Biotechnol 29, 143-148 (2011))によって記載された構造と類似している。これらのタンパク質は、TALエフェクター反復アレイならびにN末端核局在化シグナル(NLS)およびC末端活性化ドメイン(VP64またはp65)の側面に位置するΔ152N末端領域および+95C末端領域を含む。 内在性のヒトVEGF−A遺伝子、miR−302/367クラスター遺伝子およびNTF3遺伝子を標的とする、16個のTALE−活性化因子の活性を示す図である。3つの遺伝子標的のすべてについて、VP64(緑色のバー)またはNF−KB p65(青色のバー)活性化ドメインを持つTALE−活性化因子で、実験を3回行った。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。(a)VEGF−Aを標的とするTALE−活性化因子。VEGF−Aタンパク質の活性化倍数値は、方法に記載されているように測定した。星印は、片側の、対応があるt検定で測定した場合、1より有意に大きい値で、VEGF−Aの活性化倍数を誘導した活性化因子を示す。星印は、片側の対応があるt検定で測定した場合、対照と比較してNTF3転写物レベルの有意な上昇が誘導された活性化因子を示す。 内在性のヒトVEGF−A遺伝子、miR−302/367クラスター遺伝子およびNTF3遺伝子を標的とする、16個のTALE−活性化因子の活性を示す図である。3つの遺伝子標的のすべてについて、VP64(緑色のバー)またはNF−KB p65(青色のバー)活性化ドメインを持つTALE−活性化因子で、実験を3回行った。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。(b)miR−302/367を標的とするTALE−活性化因子。miR−302a転写物の活性化倍数値は、方法に記載されているように測定した。星印は、片側の、対応があるt検定で測定した場合、1よりも有意に大きいレベルまで、miR−302a転写物レベルの活性化倍数を誘導した活性化因子を示す。星印は、片側の対応があるt検定で測定した場合、対照と比較してNTF3転写物レベルの有意な上昇が誘導された活性化因子を示す。 内在性のヒトVEGF−A遺伝子、miR−302/367クラスター遺伝子およびNTF3遺伝子を標的とする、16個のTALE−活性化因子の活性を示す図である。3つの遺伝子標的のすべてについて、VP64(緑色のバー)またはNF−KB p65(青色のバー)活性化ドメインを持つTALE−活性化因子で、実験を3回行った。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。(c)NTF3を標的とするTALE−活性化因子。GAPDH mRNAと比較したNTF3 mRNAの発現レベルを示す。星印は、片側の対応があるt検定で測定した場合、対照と比較してNTF3転写物レベルの有意な上昇が誘導された活性化因子を示す。 TALE−活性化因子の活性と、前述した計算的に由来する標的部位ガイドライン違反との間の相関関係を示す図である。(d)ガイドライン違反とヒトVEGF−A遺伝子を標的とした54個のTALE−活性化因子の活性。相関p値を示す。 TALE−活性化因子の活性と、前述した計算的に由来する標的部位ガイドライン違反との間の相関関係を示す図である。(e)(d)の場合と同一データだが、それぞれがオーバーラップ部位を標的とした14.5、16.5、18.6、20.5、22.5または24.5のTALエフェクター反復アレイを含む6個のTALE−活性化因子からなる9セットへ分けた。 (a)VEGF−A内のTALE−活性化因子結合部位の概略模式図である。太い黒線はエクソンを示し、細い黒線はイントロンまたはプロモーター領域を示し、黒い矢印は転写の開始部位を示す。太い青線は、miRNAを表す。灰色のバーは、デジタルDNaseI高感受性領域を示す。本発明者らが標的とするDNaseI高感受性領域を拡大し、赤い矢印は、DNA上で結合した時、TALE−活性化因子結合部位の正確な位置と活性化因子の向きを表す(矢印はその標的DNA部位に結合した時、アミノ末端からカルボキシ末端までタンパク質の方向を示す)。 (b)miR−302/367内のTALE−活性化因子結合部位の概略模式図である。太い黒線はエクソンを示し、細い黒線はイントロンまたはプロモーター領域を示し、黒い矢印は転写の開始部位を示す。太い青線は、miRNAを表す。灰色のバーは、デジタルDNaseI高感受性領域を示す。本発明者らが標的とするDNaseI高感受性領域を拡大し、赤い矢印は、DNA上で結合した時、TALE−活性化因子結合部位の正確な位置と活性化因子の向きを表す(矢印はその標的DNA部位に結合した時、アミノ末端からカルボキシ末端までタンパク質の方向を示す)。 (c)NTF3遺伝子プロモーター領域内のTALE−活性化因子結合部位の概略模式図である。太い黒線はエクソンを示し、細い黒線はイントロンまたはプロモーター領域を示し、黒い矢印は転写の開始部位を示す。太い青線は、miRNAを表す。灰色のバーは、デジタルDNaseI高感受性領域を示す。本発明者らが標的とするDNaseI高感受性領域を拡大し、赤い矢印は、DNA上で結合した時、TALE−活性化因子結合部位の正確な位置と活性化因子の向きを表す(矢印はその標的DNA部位に結合した時、アミノ末端からカルボキシ末端までタンパク質の方向を示す)。 可能性のあるTALE−活性化因子結合部位を同定する、例示的な方法のフローチャートを示す図である。 本方法に用いられる計算装置の例を示す図である。
TALE−活性化因子は幅広い応用の可能性があるが、文献に記載されたように、現在までのところ、これらのタンパク質の低い活性と限定された標的範囲により、この技術の頑健性に対して懸念が生じる。内在性遺伝子用に作製された、公開されたTALE−活性化因子は通常、非常に適度の活性を示し3−6,8,9、前述した26個のタンパク質のうち13個が(そのために、量的情報が利用可能である)3倍以上に標的遺伝子発現を誘導し、26個中わずか4個が5倍以上活性化した(表1)。
これらの低い活性が観察されたことについての1つの可能性のある説明は、いくつかのDNA配列がTALE−活性化因子によって標的とされるには最適状態に及ばない場合があるということであり、Bogdanoveと同僚らによって、最近、ある概念が標的部位を選択するための計算機的に導かれた5つのガイドラインに体系化された(Doyle, E.L. et al., Nucleic Acids Res 40, W117-122 (2012)、さらに以下で論ずる)。これに合わせて、上述の26個の公開されたTALE−活性化因子に対する20個の標的部位のうちの19個は、これらの5つのガイドラインの1つまたは複数に適合しない(表2)。さらに以下で論じられるように、低い活性化倍数値が観察された別の可能性のある理由は、以前の研究に使用されたさまざまなTALE−活性化因子構造のいくつかが最適でない場合があるということがありえる。しかし、内在性遺伝子標的2,4,5,7,9,10上で試験されたTALE−活性化因子を構築するために現在まで用いられた7つの異なる構造は、比較的少ない数の部位でのみ評価されたので、個々の効率を評価することが困難であった(表1および2)。したがって、広い標的範囲を持ち、頑健で十分に検証されたTALE−活性化因子のプラットホームは、まだこれらのタンパク質を使用することに関心がある研究者に同定されていない。
本明細書に記載されているのは、単一の一般的な構造上に構築されたTALE−活性化因子であり、この構造ではヒト細胞でこれらのタンパク質の活性に影響を及ぼすパラメータおよび影響を及ぼさないパラメータが系統的に定められる。本明細書で示すように、いくつかの重要な定義された長さのTALE−活性化因子は、ヒト細胞においてタンパク質コーディング遺伝子のみならず、非コーディングマイクロRNA(miRNA)遺伝子の転写も頑健に活性化することができる。さらに、現在のプラットホームで作製されたTALE−活性化因子は、標的部位選択を制限する前述の計算機的に導かれた5つのガイドラインのうちの4つによって束縛されず(Doyle, E.L. et al., Nucleic Acids Res 40, W117-122 (2012))、それによって、これらのタンパク質の標的範囲が大いに拡大する。最後に、標的遺伝子発現のレベルは、使用する特異的な活性化ドメインを変えることによって、および/またはTALE−活性化因子の能力を利用することによって、天然に存在する転写因子のように、相乗的に機能するために可変的に調整することができる。まとめると、現在のデータは、公表された文献に反して、TALE−活性化因子が本当に、ヒト細胞で広作動域にわたって、本質的に対象のいかなる内在性遺伝子の発現でも制御するための頑健なプラットホームであるという明白で大規模な証拠を提供する。
単量体TALE−活性化因子結合部位を選択するためのガイドラインおよび標的範囲に及ぼす影響
Cermakらは、最初は、改変された二量体TALENの最適なTALE−活性化因子結合部位を同定するための5つのガイドラインを提案した(Cermak, T. et al. Nucleic Acids Res 39, e82 (2011))。これらのガイドラインは、天然に存在するTALエフェクターの結合選択性に関するデータから計算機的に導かれたが、実験的には前向きに検証されなかった。以前に要約されたように(Doyle, E.L. et al. Nucleic Acids Res 40, W117-122 (2012))、Cermakガイドラインは以下のように示すことができる。
1. TALE−活性化因子結合部位の1番目のヌクレオチドのすぐ5’側にあるヌクレオチドは、チミンでなければならない。
2. TALE−活性化因子結合部位の1番目のヌクレオチドは、チミンであってはならない。
3. TALE−活性化因子結合部位の2番目のヌクレオチドは、アデノシンであってはならない。
4. TALE−活性化因子結合部位の最も3’側にあるヌクレオチドは、チミンでなければならない。
5. TALE−活性化因子結合部位の塩基組成は、天然に存在する結合部位の観察された組成パーセントと2標準偏差を超えて異なってはならない。天然に存在するTALエフェクター反復アレイ結合部位の組成パーセントは、次のように定量した。A=31±16%、C=37±13%、G=9±8%、T=22±10%。したがって、TALE−活性化因子結合部位の塩基組成は、以下の通りでなければならない。A=0〜63%、C=11〜63%、G=0〜25%、T=2〜42%。
以前の大規模な研究において、ガイドライン2〜5の1つまたは複数に違反する標的結合部位のために、高活性な二量体TALENを作製することが可能であることが証明された(標的とする部位のどれもガイドライン1に違反しない)(Reyon, D. et al. Nat Biotechnol 30, 460-465 (2012))。本明細書に示されるように、ガイドライン違反の数と改変された二量体TALENの活性との間に有意な相関関係は存在しない(Reyon, D. et al. (2012))。これらの結果は、二量体TALENの標的部位を選択する場合、ガイドライン2〜5に従う必要はないことを強く示唆した。
最近、Doyleらは、単量体TALエフェクター型のタンパク質のための標的結合部位選択は、これらの同一の5つのガイドラインによって制限されなければならないことを示唆した(Doyle, E.L. et al. Nucleic Acids Res 40, W117-122 (2012))。TALE−活性化因子で使用する単量体TALエフェクター反復アレイの標的部位を選択する時、Bogdanoveと同僚らによって最近開発されたTALE−NT 2.0ウェブ系のソフトウェアツール(boglab.plp.iastate.edu)(Doyle, E.L. et al. Nucleic Acids Res 40, W117-122 (2012))がそのデフォルト設定にこれらの5つのガイドラインも適用している。

これらの先行技術ガイドラインの実行は、改変された単量体TALE−活性化因子の標的範囲を実質的に制限する影響を持つ。例えば、5つのガイドラインを適用すると、標的にできる18bpの部位(16.5のTALエフェクター反復アレイに結合される)の同定は、ランダムなDNA配列の27bpごとに1回に制限される。対照的に、ガイドライン2〜5を緩和すると、標的にできる18bpの部位を、ランダムなDNAの2bpごとに1回見つけることができるようになり、標的範囲が13倍超に改善する。
したがって、いくつかの実施形態において、現在の方法は、結合部位がDNaseI高感受性領域の中にあるTALE−活性化因子結合部位を選択することを含み、標準的TALE−反復ドメイン結合部位の1番目のヌクレオチドのすぐ5’側にあるヌクレオチドはチミンであり、結合部位は18〜24bpの長さ(5’Tを含めて)である。
いくつかの実施形態において、以下の1つまたは複数も真である:
A. TALE−活性化因子結合部位の1番目のヌクレオチドは、チミンである、
B. TALE−活性化因子結合部位の2番目のヌクレオチドは、アデノシンである、
C. TALE−活性化因子結合部位の最も3’側にあるヌクレオチドは、チミンではない、および/または
D. TALE−活性化因子結合部位の塩基組成は、天然に存在する結合部位の観察された組成パーセントと2標準偏差を超えて異なる、すなわち、A=0〜63%、C=11〜63%、G=0〜25%、T=2〜42%以外である。
いくつかの実施形態において、B〜Dの1つまたは複数、例えば、すべてが、真であるというわけではない。
TALE−活性化因子を改変する方法
本明細書に記載されているのは、ヒト細胞で内在性の遺伝子発現を頑健に活性化させるために使用可能なTALE−活性化因子構造の大規模なバリデーションおよび最適化である。この構造に対するTALエフェクター反復数の影響の系統的検定により、16.5〜22.5反復(標的部位は、長さが18〜24bpで、結合部位の5’末端がT)からなるTALE−活性化因子が最適活性を有することが証明された。データより、この構造上に作られるTALE−活性化因子は、公表された計算機的に導かれた5つのガイドラインのうちの4つを厳守する必要はないことを示す明確な実験的な証拠も提供され(Doyle, E.L. et al., Nucleic Acids Res 40, W117-122 (2012))、それによって、このプラットホームの標的範囲が、ランダムなDNA配列の2bpごとに1つの18bp部位まで大いに拡大する。これらのパラメータは、既知または予測されたDNaseI高感受性部位内の部位を標的とするTALE−活性化因子を前向きに作製すること、ならびにタンパク質コーディング遺伝子およびmiRNAクラスター遺伝子上で高い活性と高い成功率を示すこと、より頑健ではない活性化を記載した以前に公表した研究に対比して支持する結果、によって検証された(表1)。
したがって、本明細書に記載された方法は、対象の標的配列、好ましくは標的遺伝子の制御領域、例えば、プロモーターの一部であるかまたはそれを含む標的配列を選択することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、例えば、1つまたは複数のデータベースとの比較に基づき、既知のDNaseI高感受性領域にある標的配列を選択することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、DNaseI高感受性領域内にある標的配列を同定するための、当技術分野で知られたDNaseI過敏性検定を実行することを含む。
方法は、本明細書に示すガイドラインに基づいて、可能性のある(または候補となる)TALE−活性化因子結合部位(すなわち、TALE−活性化因子結合部位は18〜24bpの長さで好ましくは5’Tを含む)、を同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ユーザは、例えば長さの入力ボックスに新しい値を入力して、この長さの制約を変えることができる。本明細書に記載される研究は、16.5〜22.5の反復(好ましくは5’Tを含み、18〜24bpの長さの部位に結合する)からなるTALエフェクター反復アレイは、TALE−活性化因子の頑健な活性を確実に持つように作製されなければならないことを示唆する。
一度、本明細書に記載される方法を用いて結合部位が同定されると、方法は、同定された結合部位と結合するTALE−活性化因子を生成することをさらに含むことができる。TALE−活性化因子は、転写活性化因子に融合するTALエフェクター反復アレイアセンブリ(同定された結合部位と結合する)を含む。TALE−活性化因子に使用することができる転写活性化因子は、当技術分野で、例えば、1つまたは複数の、好ましくは4つのVP16ペプチド(すなわち、VP64)、またはNF−KB p65トランス活性化ドメインが知られている。例えば、Tremblay et al., Hum Gene Ther. 2012 Aug 23(8):883-90、Li et al., Scientific Reports 2:897 (2012) DOI: 10.1038/srep00897、およびUS20110301073を参照されたい。
TALエフェクター反復アレイは、一般的に33〜35個のアミノ酸の長さのタンデムリピートを含む。各々の反復は、12番目および13番目の2つの可変的なアミノ酸である反復可変性2残基(RVD:repeat variable di−residue)を除いてほとんど同一である。C末端の反復は一般により短く、「ハーフリピート」と呼ばれる。各々の反復は、簡単なコードに基づいて単一塩基対と結合する。最も一般的な4つのRVDは、各々優先して4つの塩基のうちの1つと結合する(HDはCに、NIはAに、NGはTに、NNはGに)(例えば、Li et al., Scientific Reports 2:897 (2012)、Boch et al., Review of Phytopathology 48: 419-36、US20110301073を参照されたい)。したがって、N.5ドメインを持つ改変されたTALE−活性化因子タンパク質は、N.5+1.5bpの長さ(5’Tを含む)の部位と接触する。例えば、本明細書に記載の12.5ドメインの長さのTALE−活性化因子タンパク質は、もし存在するならば5’Tを含めて14bpの部位と、または、5’Tがなければ13bpの部位と接触する。
TALエフェクター反復アレイアセンブリのための多くの方法が、当技術分野で知られており(例えば、REAL(Sander, J.D. et al. Nat Biotechnol 29, 697-698 (2011)、Reyon, D. et al. Curr Protoc Mol Biol., 2012 Oct;Chapter 12:Unit12.15)、REAL−Fast(Reyon, D. et al. Curr Protoc Mol Biol., 2012 Oct;Chapter 12:Unit12.15)、またはFLASH(Reyon, D. et al. Nat Biotechnol 30, 460-465 (2012)およびPCT/US2012/046451))、本レポートで使用される構造上でTALE−活性化因子を構築するのに用いることができる。REALを実行するために必要なすべてのプラスミドは、非営利的プラスミド配送サービスAddgene(addgene.org/talengineering/)を通して入手可能である。FLASHおよびREAL−Fastを実行するために必要な376種類のプラスミドのアーカイブも利用できる(TALengineering.org)。当技術分野で知られている分子生物学的技術を、TALE−活性化因子を構築するために用いることができる。例えば、Tremblay et al., Hum Gene Ther. 2012 Aug;23(8):883-90、Li et al., Scientific Reports 2:897 (2012) DOI: 10.1038/srep00897、およびUS20110301073を参照されたい。
DNaseI高感受性部位
本明細書で使用されるように、「DNaseI高感受性領域部位」は、DNaseIの優れた感度によって識別されて切断されるクロマチンの短い領域である。DNaseI高感受性部位は、例えば経験的に、当技術分野で知られている方法を用いて同定することができるか、または、公開されたデータまたはDNaseI高感受性部位のデータベースに基づいて同定することができる。例えば、DNaseIフィンガープリント法は、無傷の核のDNaseI消化、Saboら(Nat Methods. 2006 Jul;3(7):511-8.)が記載しているDNaseI『ダブルヒット』フラグメントの単離、およびIllumina IIx(および2011年前半までのIllumina HiSeq)プラットホーム(36bpリード)を用いたフラグメント末端(生体内DNaseI切断部位と一致する)の直接シーケンスを含む方法によって実行することができる。高品質のリードの一意的なマッピングは、Bowtieを用いてゲノムにマッピングすることができる。DNaseIの感度は未加工のタグ密度に直接反映され、それは150bpの移動窓(ゲノムを横断する20bpのステップで)の範囲内にマッピングされるタグ密度としてトラックに示される。DNaseI感受性ゾーン(ホットスポット)を、次いで、Saboら(Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Nov 30;101(48):16837-42)に記載されたホットスポットアルゴリズムを使用して同定することができる。いくつかの実施形態において、1.0%の偽発見率(FDR:false discovery rate 1.0%)閾値は、ホットスポットアルゴリズムを等価数のランダムな一意的なマッピングの36merに適用することによって、各々の細胞型に対して計算される。DNaseI高感受性部位(DHS:DNaseI hypersensitive siteまたはピーク)は、次いでピーク発見アルゴリズムを用いて、FDR 1.0%の高感受性ゾーンの範囲内にシグナルピークとして同定される(I−max)。
DNaseI高感受性部位を同定する他の方法を使用することもできる。例えば、Madrigal and Krajewski, Front Genet. 2012; 3:230、Wu, Nature. 1980 Aug 28; 286(5776):854-60、Gross and Garrard, Annu Rev Biochem. 1988; 57:159-97、Boyle et al., Cell. 2008 Jan 25; 132(2):311-22を参照されたい。McDaniellら、DNaseI高感受性部位のデータベースを使用して候補サブサイトを同定および選択することもできる(例えば、ワシントン大学ENCODEデータ中に同定されたDNaseI高感受性領域)。そのような部位は、UCSCゲノムブラウザー(genome.ucsc.edu、Rosenbloom et al. Nucleic Acids Res 40, D912-917 (2012))を使用して同定することができる。
いくつかの実施形態において、対象の特定の細胞型から得た経験的なDNaseI感受性データが用いられ、すなわち、転写の増加が要求される同一の細胞型(すなわち、標的細胞型)。いくつかの実施形態において、複数の異なる細胞型でDNaseI高感受性部位であると同定されたDNaseI高感受性部位を、これらの領域は標的細胞型のオープンクロマチンである可能性が高いという推論に基づいて選択する。
コンピュータおよびソフトウェアに基づく実施形態
いくつかの実施形態において、ここに記載されたシステムおよび方法のさまざまな実行は、デジタル電子回路、集積回路、特注の特定用途向け集積回路(ASIC:application specific integrated circuit)、コンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェアおよび/またはその組み合わせで実現することができる。これらのさまざまな実行は、少なくとも1台のプログラム可能なプロセッサを含むプログラマブルシステム上で実行可能および/または解釈可能な1つまたは複数のコンピュータプログラムに、実装を含めることが可能で、記憶装置、少なくとも1台の入力装置、および少なくとも1台の出力装置からデータと命令を受信すること、およびデータと命令を転送することを連結した、特別なまたは一般的な目的である場合がある。
これらのコンピュータプログラム(別名プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーションまたはコード)は、プログラム可能なプロセッサのためにマシン命令を含み、高水準手続き型プログラミング言語および/またはオブジェクト指向プログラミング言語で、および/またはアセンブリ言語/機械語で実装することができる。本明細書で用いられるように、「マシン可読媒体」および「コンピュータ可読媒体」という用語は、マシン命令をマシン可読シグナルとして受信するマシン可読媒体を含む、マシン命令および/またはデータをプログラム可能なプロセッサに提供するために用いられる、任意の計算機プログラム製品、機器および/または装置(例えば、磁気ディスク、光ディスク、メモリ、プログラマブルロジックデバイス(PLD:Programmable Logic Device))を指す。「マシン可読シグナル」という用語は、マシン命令および/またはデータをプログラム可能なプロセッサに提供するために用いられる任意のシグナルを指す。
ユーザとの対話を可能にするために、ここに記載されるシステムおよび技術を、情報をユーザに表示するための表示装置(例えば、ブラウン管(CRT:cathode ray tube)モニタまたは液晶ディスプレイ(LCD:liquid crystal display)モニタ)およびキーボード、ならびにポインティング装置(例えば、マウスまたはトラックボール)を備えたコンピュータに実装することができ、これによってユーザはコンピュータに入力が可能になる。他の種類の装置も同様に、ユーザとの対話を可能にするために、使用することができる。例えば、ユーザに提供されるフィードバックは、感覚のフィードバック(例えば、視覚フィードバック、聴覚フィードバックまたは触覚フィードバック)のどのような形でもよく、ユーザからの入力は、音響入力、音声入力または触覚入力を含む、どのような形でも受信することができる。
ここに記載されるシステムおよび技術は、バックエンド構成要素(例えば、データサーバとして)を含む計算機システム、またはミドルウェア構成要素(例えば、アプリケーションサーバ)を含む計算機システム、またはフロントエンド構成要素(例えば、グラフィックユーザインタフェースまたはウェブブラウザーを備えたクライアントコンピュータで、これによりユーザはここで記載されるシステムおよび技術の実行と対話することができる)を含む計算機システム、あるいはそのようなバックエンド構成要素、ミドルウェア構成要素またはフロントエンド構成要素の任意の組み合わせに実装することができる。システムの構成要素は、デジタルデータ通信(例えば、通信ネットワーク)のどのような形式または媒体ででも相互接続することができる。通信ネットワークの例には、ローカルエリアネットワーク(「LAN:local area network」)、ワイドエリアネットワーク(「WAN:wide area network」)およびインターネットが含まれる。
計算機システムには、クライアントとサーバを含めることができる。クライアントとサーバは、通常、互いに離れていて、一般的に通信ネットワークを通して対話する。クライアントとサーバの関係は、それぞれのコンピュータで作動し、互いにクライアント−サーバ関係があるコンピュータプログラムによって生じる。
いくつかの実施形態において、可能性のあるTALE−活性化因子結合部位のコンピュータに基づく同定は、図4に示すように実行される。いくつかの実施形態において、同定には、標的配列を含むユーザが入力したクエリーとデータベースに保管された高感受性領域に関連したレコードとの比較が含まれる。計算機システムは、標的遺伝子に関連した情報を受け取るためのユーザ入力機構を含むユーザインタフェースを、ユーザ装置に表示させる(101)。対象の標的配列、好ましくは標的遺伝子の制御領域、例えば、プロモーターの一部であるかまたはそれを含む標的配列は、ユーザによって、例えば、クエリーボックスに入力することによって、現在の方法を実行するようにプログラムされたコンピュータプロセッサに提供される。制御領域は、当技術分野で知られている方法、例えば、データベース、または実証研究を使用して同定することができる。システムはユーザ入力クエリーを受け取り(102)(任意選択でクエリーをフォーマットする)、データベースから1つまたは複数のレコードを選択するために、クエリーを使用する。いくつかの実施形態において、プロセッサは計算機システムでアクセス可能な1つまたは複数のデータベースに保存されたレコードとの比較に基づいて、標的配列の中で、DNaseI高感受性領域を同定する。いくつかの代替の実施形態において、ユーザは、すでにDNaseI高感受性領域内にあることが知られている標的配列を提供する。いくつかの実施形態において、DNaseI高感受性領域は経験的に同定することができ、配列はコンピュータに入力された。
DNaseI高感受性領域が同定されると、プロセッサは次いで、本明細書で示すガイドラインに基づいてその領域の範囲内に可能性のあるTALE−活性化因子結合部位、すなわち、18〜24bpの長さの部位に結合する、16.5〜22.5の反復からなるTALE−活性化因子結合部位を同定する(103)。いくつかの実施形態において、例えば、長さの入力ボックスに新しい値を入力することによって、ユーザはこの長さの制約を変えることができる。ユーザによって入力された長さの制約の変更は、最初のクエリー定義の一部として、または、事前の検索に基づいて提供された1組の結果をさらに選別する方法として計算機システムによって受け取られる可能性がある。本レポートの研究は、16.5〜22.5の反復(18〜24bpの長さの部位に結合する)からなるTALエフェクター反復アレイのみがTALE−活性化因子の頑健な活性を確実に持つようにしなければならないことを示唆する。プロセッサは、次いでTALE−活性化因子結合部位である可能性の配列を1つまたは複数選択し(104)、同定されたTALE−活性化因子結合部位である可能性の配列をユーザに、例えば、スクリーン上のディスプレイ、コンピュータ可読媒体の記憶装置、または、電子メールなどのメッセージへの封入によって提供する(105)。
いくつかの実施形態において、計算機システムはTALE−活性化因子を生成するために必要な情報を含むデータベースと関係している。TALE−活性化因子結合部位の同定の際に、ソフトウェアは追加の保存された情報にアクセスし、例えばFLASHまたはREAL/REAL−Fastを用いて、ユーザにTALE−活性化因子を生成するために必要なさらなる情報へのアクセスを提供してよい。例えば、いくつかの実施形態において、選択したアセンブリの方法に従い(FLASHまたはREAL/REAL−Fast)、計算機システムは、アセンブリのために必要なプラスミドの名前に関する情報と、任意に印刷できるグラフィックガイドをユーザに提供する。REALを実行するために必要なすべてのプラスミドは、非営利的プラスミド配送サービスAddgene(addgene.org/talengineering/)を通して入手可能である。FLASHおよびREAL−Fastを実行するために必要な376種類のプラスミドのアーカイブも利用できる(TALengineering.org)。
図5は一般的なコンピュータ装置900と一般的なモバイル計算装置950の例を示し、それらはここに記載された技術と共に使用してよい。計算装置900は、ラップトップ、デスクトップ、ワークステーション、携帯情報端末、サーバ、ブレードサーバ、メインフレームおよび他の適切なコンピュータなどのデジタル計算機のさまざまな形式を表すことを意図している。計算装置950は、携帯情報端末、携帯電話、スマートフォンおよび他の類似した計算装置などのモバイル装置のさまざまな形式を表すことを意図している。ここで示される構成要素、それらの接続および関係、ならびにそれらの機能は、例示的であるだけで、記載されたおよび/または主張された実装例を限定するものではない。
計算装置900は、プロセッサ902、メモリ904、記憶装置906、メモリ904および高速拡張ポート910に接続する高速インタフェース908、ならびに低速バス914および記憶装置906に接続する低速インタフェース912を含む。構成要素902、904、906、908、910および912の各々は、さまざまなバスを使用して相互接続し、共通のマザーボード上に、または、必要に応じて他の方法で装着してよい。プロセッサ902は、外部入出力装置(例えば高速インタフェース908に連結したディスプレイ916)にGUIのグラフィック情報を示すための、メモリ904の中、または、記憶装置906に保存された命令を含む実行命令を、計算装置900の中で処理することができる。他の実装例では、必要に応じて、複数のメモリおよびメモリの種類とともに、複数のプロセッサおよび/または複数のバスが使用してよい。また、複数の計算装置900を、必要な操作(例えば、サーバ列、一群のブレードサーバ、またはマルチプロセッサシステムとして)の部分を提供している各々の装置と連結してよい。
メモリ904は、計算装置900の中に情報を保存する。一実装例では、メモリ904は1つまたは複数の揮発性メモリユニットである。他の実装例では、メモリ904は1つまたは複数の不揮発性メモリユニットである。メモリ904は、磁気ディスクまたは光ディスクなどのコンピュータ可読媒体の別の形式であってよい。
記憶装置906は、大容量記憶装置を計算装置900に提供することができる。一実装例では、記憶装置906は、フロッピーディスク装置、ハードディスク装置、光ディスク装置、もしくはテープ装置、フラッシュメモリもしくは他の類似したソリッドステートメモリ装置、または保存領域ネットワークもしくは他の構成の装置を含む一連の装置などのコンピュータ可読媒体であってよく、あるいはそれを含んでよい。コンピュータプログラム製品を、情報担体に明らかに組み入れることができる。コンピュータプログラム製品は、実行される時、上述の方法などの、1つまたは複数の方法を実行する命令も含んでよい。情報担体は、メモリ904、記憶装置906、プロセッサ902上のメモリ、または伝搬したシグナルなどのコンピュータ可読媒体またはマシン可読媒体である。
低速制御装置912がより低帯域幅集約型の動作を管理する一方で、高速制御装置908は計算装置900のために帯域幅集約型の操作を管理する。このような機能の割り当ては、例示であるだけである。一実装例では、高速制御装置908は、メモリ904、ディスプレイ916(例えば、グラフィックスプロセッサまたはアクセラレータを介して)、および高速拡張ポート910に結合し、さまざまな拡張カード(図示せず)を取り付けてよい。実装例では、低速制御装置912は、記憶装置906と低速拡張ポート914に結合する。低速拡張ポートは、さまざまなコミュニケーションポート(例えば、USB、ブルートゥース、イーサネット、無線イーサネット)を含んでよく、例えばキーボード、ポインティング装置、スキャナ、または例えばネットワークアダプタを介したスイッチもしくはルータなどのネットワーク装置、などの1つまたは複数の入出力装置に結合してよい。
図に示すように、計算装置900はいくつかの異なる形で実装される場合がある。例えば、それは標準規格サーバ920、または一群のそのようなサーバの複数回として実装してよい。それは、ラックサーバシステム924の一部として実装してもよい。さらに、それはラップトップコンピュータ922のようなパーソナルコンピュータで実装してよい。あるいは、計算装置900の構成要素を、モバイル装置の(図示せず)他の構成要素(例えば装置950)と組み合わせてよい。そのような装置の各々は、1つまたは複数の計算装置900、950を含めてよく、システム全体は互いに通信している複数の計算装置900、950から構成される場合がある。
計算装置950は、その他の構成要素の中で、プロセッサ952、メモリ964、入出力装置(例えばディスプレイ954)、通信インタフェース966、およびトランシーバ968を含む。追加の記憶装置を提供するために、装置950は記憶装置、例えばマイクロドライブまたは他の装置を備えてもよい。構成要素950、952、964、954、966および968の各々は、さまざまなバスを使用して相互接続し、構成要素のいくつかを共通のマザーボード上に、または、必要に応じて他の方法で装着してよい。
プロセッサ952は、メモリ964に保存された命令を含む計算装置950の中で、命令を実行することができる。プロセッサは、別々で複数のアナログプロセッサおよびデジタルプロセッサを含むチップのチップセットとして実装してよい。プロセッサは、例えば、ユーザインタフェースの制御、装置950が実行するアプリケーション、および装置950での無線通信、などの装置950の他の構成部品の調整を提供する場合がある。
プロセッサ952は、制御インタフェース958およびディスプレイ954に連結したディスプレイインタフェース956を介してユーザと情報交換する場合がある。ディスプレイ954は、例えば、薄膜トランジスタ液晶ディスプレイLCD(TFT LCD:Thin−Film−Transistor Liquid Crystal Display)、または有機発光ダイオード(OLED:Organic Light Emitting Diode)ディスプレイ、または他の適切なディスプレイ技術である場合がある。ディスプレイインタフェース956は、画像および他の情報をユーザに示すためにディスプレイ954を動かす適切な回路を含む場合がある。制御インタフェース958はユーザからコマンドを受け取り、プロセッサ952に送出するためにコマンドを変換する場合がある。さらに、他の装置と装置950との近い領域のコミュニケーションを可能にするように、外部インタフェース962はプロセッサ952と連絡して提供される場合がある。外部インタフェース962は、例えば、いくつかの実装例において有線通信を、または、他の実装例において無線通信を提供する可能性があり、複数のインタフェースが使用される場合もある。
メモリ964は、計算装置950の中に情報を保存する。メモリ964は、1つまたは複数のコンピュータ可読媒体、1つまたは複数の揮発性メモリユニット、または1つまたは複数の不揮発性メモリユニットとして実装することができる。拡張メモリ974も、提供され、拡張インタフェース972を介して装置950と接続されてもよく、例えば、シングルインラインメモリモジュール(SIMM:Single In Line Memory Module)カードインタフェースを含めてもよい。そのような拡張メモリ974は、追加の記憶領域を装置950に提供してよく、装置950のアプリケーションまたは他の情報も保存してもよい。具体的には、拡張メモリ974は上述のプロセスを実行するか、または補うようにという命令を含んでよく、安全性情報も含めてよい。このように、例えば、拡張メモリ974は装置950用のセキュリティモジュールとして提供される場合があり、装置950の安全な使用を可能にする命令でプログラムされる可能性がある。さらに、不正侵入できない方法でSIMMカードに識別情報を設定するような追加情報とともに、安全なアプリケーションが、SIMMカードによって提供される場合がある。
以下に記すように、メモリは、例えば、フラッシュメモリおよび/またはNVRAMメモリを含む場合がある。ある実装例では、コンピュータプログラム製品を、情報担体に明らかに組み入れる。コンピュータプログラム製品は、実行される時、上述の方法などの1つまたは複数の方法を実行する命令を含む。情報担体は、メモリ964、拡張メモリ974、プロセッサ952上のメモリ、または、例えばトランシーバ968もしくは外部インタフェース962によって受信された、伝搬されたシグナルなどのコンピュータ可読媒体またはマシン可読媒体である。
装置950は、通信インタフェース966を介してワイヤレスで通信してよく、必要な場合、デジタル信号処理回路を含んでよい。通信インタフェース966は、さまざまなモードまたはプロトコル、例えば、数ある中で、GSM音声通話、SMS、EMSまたはMMSメッセージ交換、CDMA、TDMA、PDC、WCDMA、CDMA2000またはGPRSなどのもとで通信を提供してよい。そのような通信は、例えば、高周波トランシーバ968を介して生じる場合がある。さらに、狭域通信は、例えばブルートゥース、WiFiまたはその他の同様なトランシーバ(図示せず)などを使用して生じる場合がある。さらに、全地球測位システムGPS(GPS:Global Positioning System)レシーバモジュール970は、さらなるナビゲーション関連および位置関連の無線データを装置950に提供する場合があり、装置950で動くアプリケーションによって適切に使用される可能性がある。
装置950は音声コーデック960を用いて聞き取れるように通信してよく、ユーザから口頭の情報を受け取り、それを使用可能なデジタル情報に変換してよい。例えば装置950の送受話器の、例えばスピーカを介して、音声コーデック960は同様にユーザに可聴音を生成してよい。そのような音は音声電話からの音を含んでよく、録音された音(例えば、音声メッセージ、音楽ファイル、その他)を含んでよく、および装置950で作動しているアプリケーションで生成する音を含んでもよい。
図に示すように、計算装置950はいくつかの異なる形で実装される場合がある。例えば、それは携帯電話980として実装される場合がある。それは、スマートフォン982、携帯情報端末または他の類似したモバイル機器の一部として実装される場合もある。
本明細書に記載され、図に示されたステップに加えて、他のステップが提供されてよく、または記載されたフローからステップが除かれてよく、および他の構成要素は記載されたシステムに加えられるか、それから除去されてよい。したがって、他の実施形態は、本発明の範囲内である。
標的遺伝子の発現レベルを最適化する方法
現在までに記載された、さまざまなTALE−活性化因子構造に存在する変形には、少なくとも3つの原因がある。(1)TALエフェクター反復内の、高頻度可変性残基以外の位置に存在するアミノ酸の可変性、(2)TALエフェクター反復アレイの側面に位置するTALエフェクター由来の配列の長さと組成の違い、および(3)使用した活性化ドメインの選択(例えば、VP16またはVP64)。Bochと同僚らは、非高頻度可変性反復位置のアミノ酸の変化が結合活性に影響を及ぼしうることを示唆するデータを最近提示した(Streubel, J., et al. Nat Biotechnol 30, 593-595 (2012))。さまざまな報告により、TALエフェクター反復アレイに隣接するTALエフェクター由来の配列の長さの違いが、TALE−活性化因子の活性に影響することができることも示された(Miller, J.C. et al. Nat Biotechnol 29, 143-148 (2011)、Zhang, F. et al. Nat Biotechnol 29, 149-153 (2011)、Mussolino, C. et al. Nucleic Acids Res 39, 9283-9293 (2011))。
本明細書に記載されているのは、TALE−活性化因子によって誘導される遺伝子発現レベルを微調整するために用いることができるいくつかの異なるアプローチであり、この技術の応用範囲を広げる重要な可能性である。
第1に、TALE−活性化因子結合の位置を変えることは(単一のDNaseI高感受性部位の中であっても)、結果として観察される活性化レベルの違いを導くことができる。現在、任意の所与の部位から、誘導される活性化レベルを予測することはできないが、現在の方法を用いて、高い成功率と容易性でTALE−活性化因子を構築することができることは、当業者にとって、異なる活性のTALE−活性化因子のパネルを生産すること、および経験的に、所望のレベルの発現を誘導する活性化因子を同定することを容易にする。
第2に、本明細書に記載されているように、16.5〜22.5のTALE反復からなるDNA結合性ドメインを選ぶことは、結果としてより高活性なTALE−活性化因子になることが予測される。
第3に、活性化ドメインを変えることで、TALE−活性化因子によって誘導される遺伝子発現レベルに影響を及ぼすことができる。例えば、本明細書で検討される2つの細胞株において、VP64 TALE−活性化因子は、一般に、p65活性化ドメインを持っている適合した対応物より高レベルの遺伝子発現を誘導した。
最後に、TALE−活性化因子の組み合わせを使うことは、相乗的に働いて標的遺伝子を活性化することができる。したがって、TALE−活性化因子の異なる組み合わせを試験して、所望の遺伝子発現レベルを見つけることができる。さらに、これらの組み合わせを使用して標的遺伝子を複数の入力に反応させることができ、擬似回路が内在性遺伝子と結びつく合成生物学の応用が可能になる。いくつかの実施形態において、すべてが同一の遺伝子を標的とするが、遺伝子の制御領域で異なる場所と結合するTALE−活性化因子の一対(またはそれ以上)が使用される。いくつかの実施形態において、TALE−活性化因子のすべては、異なるトランス活性化ドメイン、例えば、VP64とp65のTALE−活性化因子の組み合わせを有し、いくつかの実施形態において、TALE−活性化因子のすべては、同一のトランス活性化ドメイン、例えば、すべてがVP64またはp65ドメインのどちらかを有する。
非コーディング遺伝子の発現を調節する方法
TALE−活性化因子を使用してmiRNAクラスターの発現を調節することができ、したがってlincRNA、snoRNAまたはpiRNAなどの非コーディング遺伝子の他の種類の発現を増加させるために使用できることも現在のデータは示している。したがって、いくつかの実施形態において、方法は非コーディング遺伝子の制御領域内のTALE−活性化因子結合部位を選択することを含む。
本発明は以下の実施例にさらに記載され、それは特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない。
方法
次の方法が、以下の実施例に記載された実験で用いられた。
TALE−活性化因子結合部位の選択。ヒトVEGF−A遺伝子については、以前293細胞について記載したDNaseI高感受性部位内の標的部位を選択した(Liu, P.Q. et al. J Biol Chem 276, 11323-11334 (2001))。NTF3およびmiR−302/367クラスター遺伝子については、UCSCゲノムブラウザーを用いてワシントン大学ENCODEデータから同定したDNaseI高感受性領域内の標的部位を選択した(genome.ucsc.edu、Rosenbloom, K.R. et al. Nucleic Acids Res 40, D912-917 (2012))。これらの領域が複数の異なる細胞型のDNaseI高感受性部位であると同定されたので、これらを標的とし、したがって、これらの領域はオープンクロマチンにある可能性が高いと推測した。
TALE−活性化因子の構築。TALエフェクター反復アレイをコードしているDNA断片を、前述の通り、高速ライゲーションベース自動化可能ハイスループットアセンブリ(FLASH:Fast Ligation−based Automatable High−throughput Assembly)法を使用して生成した(Reyon et al., 2012、およびPCT/US2012/046451)。これらの断片は、BsmBI制限酵素の消化によって生成した突出(オーバーハング)を用いて、EF1αプロモーターならびに前述したTALE−活性化因子NT−L+95のΔ152N末端および+95C末端TALE由来ドメインを含む発現ベクターにクローンを作製した。NF−KB p65およびVP64活性化ドメインを、+95ドメインのC末端の最後に直接融合し、すべての融合タンパク質に核局在化シグナルを持たせる。
細胞培養およびトランスフェクション。ヒトFlp−In T−REx 293細胞および初代ヒトBJ繊維芽細胞は、10%FBS、1%ペニシリン−ストレプトマイシンおよび1%Glutamaxを補充したAdvanced DMEM(Life Technologies)で維持した。細胞は、製造業者の使用説明書に従ってLipofectamine LTX(Life Technologies)またはNucleofection(Lonza)を用いてトランスフェクションした。手短に言うと、VEGF−AおよびNTF3の発現を標的としている実験では、160,000個のFlp−In T−REx 293細胞を24穴プレートに接種し、TALE−活性化因子をコードした300ngのプラスミド、30ngのpmaxGFPプラスミド(Lonza)、0.5μl Plus Reagentおよび1.65μl Lipofectamine LTXで、次の日にトランスフェクションした。miR−302/367クラスターの発現を標的としている実験では、5x10個のBJ繊維芽細胞を、TALE−活性化因子をコードした10μgのプラスミドおよび500ngのpmaxGFPプラスミドで、NHDFキット(Lonza)およびNucleofector 2bデバイス上のプログラムU−023を用いてヌクレオフェクションした。
ELISAアッセイ。Flp−In TREx 293細胞を、ヒトVEGF−A遺伝子を標的としたTALE−活性化因子をコードしているプラスミドをトランスフェクションした。すべてのトランスフェクションは、3回行った。細胞の培地をトランスフェクションの40時間後に回収し、培地へ分泌されたVEGF−Aタンパク質レベルをヒトVEGF−A ELISAキット(R&D Systems)を用いてアッセイを行った。すべての試料を、製造業者の使用説明書に従って測定した。活性化倍数値は、TALE−活性化因子を発現しているプラスミドをトランスフェクションした細胞から回収した培地のVEGF−Aレベルの平均値を、VP64またはp65活性化ドメインのみを発現しているプラスミドをトランスフェクションした細胞のVEGF−Aレベルの平均値で除することによって計算した。
定量的RT−PCRアッセイ。NTF3 mRNAレベルを測定するために、トランスフェクションの2日後に細胞を回収し、全RNAをTRIzol Plus RNA精製システム(Ambion)を使用して単離した。SuperScript III First−Strand Synthesis SuperMixおよびオリゴdTプライマー(Life Technologies)を用いてRNAを逆転写した。次いで次のTaqmanプライマー/プローブセットを用いて、GAPDHプローブをHEXでラベルしマルチプレキシングを可能にしたという変更を除いて、前述のようにqPCRを行った。−NTF3フォワードプライマー:5’−GATAAACACTGGAACTCTCAGTGCAA−3’(配列番号:52)、NTF3リバースプライマー:5’−GCCAGCCCACGAGTTTATTGT−3’(配列番号:53)、NTF3 taqmanプローブ:5’−/56−FAM/CAAACCTAC/ZEN/GTCCGAGCACTGACTTCAGA/3IABkFQ/−3’(配列番号:54)、GAPDHフォワードプライマー:5’−CCATGTTCGTCATGGGTGTGA−3’(配列番号:55)、GAPDHリバースプライマー:5’−CATGGACTGTGGTCATGAGT−3’(配列番号:56)、GAPDH taqmanプローブ:5’−/5HEX/TCCTGCACC/ZEN/ACCAACTGCTTAGCA/3IABkFQ/−3’(配列番号:57)。すべてのTALE−活性化因子をコードしているプラスミドおよび対照のプラスミドはヌクレオフェクションによって3回細胞に導入され、各々の試料について3回qRT−PCRを行った。
miR−302a転写レベルを測定するために、トランスフェクションの3日後に細胞を回収し、GFP陽性の細胞をフローサイトメトリーによって単離した。すべてのmiRNAを、mirVana miRNA単離キット(Ambion)を用いて単離した。逆転写およびqPCRは、Applied Biosystems Taqman microRNA Assays(has−miR−302aのカタログ番号は000529、およびRNU48対照のカタログ番号は001006)を用いて、製造業者の使用説明書に従って行った。miR−302a RNA転写物の活性化倍数は、TALE−活性化因子をコードしているプラスミドをトランスフェクションしたBJ繊維芽細胞の転写レベルを、VP64またはp65活性化ドメインのみを発現している対照プラスミドをトランスフェクションしたBJ繊維芽細胞の転写レベルと比較すること、および比較C(ΔΔC)法を使用することによって計算した。すべてのTALE−活性化因子および対照は3回のヌクレオフェクションによって細胞に導入され、miR302a転写物および低分子RNA対照RNU48のqRT−PCRは、各々の試料について3回行った。
(実施例1)
最初の実験では、最適なTALE−活性化因子の機能のために必要とされるTALエフェクター反復の数を定めることを目的とする系統的で大規模な研究を行った。Rebarと同僚らが以前に使用してより高活性なTALE−活性化因子を構築した構造に基づき(Miller, J.C. et al. Nat Biotechnol 29, 143-148 (2011))(図1C)、しかし、VP64活性化ドメインを有する単一で一貫した構造を利用した。最近報告された高速ライゲーションベース自動化可能固相ハイスループット(FLASH)アセンブリ法(Reyon, D. et al. Nat Biotechnol 30, 460-465 (2012)およびPCT/US2012/046451)を用いて、6組の可変長TALE−活性化因子(14.5、16.5、18.5、20.5、22.5、または24.5 TALエフェクター反復アレイを有する)を、ヒトVEGF−A遺伝子内の9つの異なる標的領域のために構築した(合計54個のTALE−活性化因子)。妨害する可能性があるクロマチンが本発明者の実験に及ぼす影響を最小にするために、選ばれた9つの領域のすべては単一の、VEGF−A転写開始点の下流500bp付近にあるDNaseI高感受性領域内にある(図1a)。顕著であるのは、試験された54個のTALE−活性化因子のうち53個は、ヒト培養細胞におけるVEGF−Aタンパク質の発現の著しい増加を、5.3倍から114倍(平均44.3の活性化倍数)の範囲まで誘導した(図1b)。興味深いことには、9個の標的領域の各々については、14.5反復および/または24.5反復TALE−活性化因子は、16.5〜22.5反復を有している他のタンパク質より実質的により低いVEGF−Aの活性化倍数を示した(図1b)。これらのデータは、単量体TALE−活性化因子のDNA結合活性は、単量体TALE−活性化因子が少なくとも16.5反復を、しかし、22.5反復以下を確実に含むことによって最適化できることを示唆する。
54個のVEGF−A標的TALE−活性化因子の活性に関するデータを用いて、次の標的部位選択のための計算的に由来する5つのガイドラインの重要性を試験した(Doyle, E.L. et al. Nucleic Acids Res 40, W117-122 (2012))。54個の標的部位のすべてが、これら5つのガイドラインの1つまたは複数と適合せず、54個の部位のうちの49個が実際に2つ以上のガイドラインに違反していた(すべての部位が5’Tを必要とするガイドラインを満たした点に注意)(表3)。5倍以上VEGF−Aの発現を増加させることを試験された54個の活性化因子のうちの53個の能力は、5つの設計ガイドラインのうちの少なくとも4つに従う絶対的な必要性がないことを明らかに証明する。ガイドライン違反の総数と観察されたTALE−活性化因子活性のレベルとの間に相関が存在する可能性があるどうか検討されたが、有意な相関関係は見つからなかった(p=0.5428、図2D)。その代わりに、誘導された活性化倍数のレベルは、主に遺伝子座関連であるように思われた−つまり、ガイドライン違反の数に関係なく、9つの遺伝子座のうちの1つを標的とする可変長のTALE−活性化因子は、活性化倍数と同程度のレベルを示す傾向がある(図2E)。したがって、より高活性の単量体TALE−活性化因子を、5つの設計ガイドラインのうちの4つを満たすことなく作製することができる。例えば、16.5のTALエフェクター反復からなるタンパク質にランダムなDNA配列の2bpごとに1回部位を作製することが可能になり、これらの規制を緩和する能力によって、10倍超TALE−活性化因子の標的範囲が改善された。

最適の反復アレイ長を定めて、標的配列を選ぶための基準を緩和して、これらのパラメータを用いて作製されたTALE−活性化因子が、ヒト細胞においてタンパク質コーディング遺伝子およびmiRNA遺伝子の両方の発現を効率的に調節するかどうか試験した。これらの実験のために、FLASHを用いて16.5または17.5のTALエフェクター反復からなるVP64 TALE−活性化因子を、ヒトVEGF−A遺伝子プロモーターの6つの付加部位に、ヒトNTF3遺伝子プロモーターの5つの部位に、および、miR−302/367クラスタープロモーターの5つの部位に構築した。混乱させる可能性がある、妨げになるクロマチンの影響を最小にするために、標的とした16の部位のすべてを、細胞型特異的またはデータベースで予測されたDNaseI高感受性領域の中のそれらの位置に基づいて再び選択した(図3A〜Bおよび方法)。ヒト細胞でこれらのVP64 TALE−活性化因子を試験することにより、16個のタンパク質のうちの15個がそれらの内在性遺伝子標的の発現の著しい増加を誘導することが明らかになり、全体的な成功率は約94%であった(図2A〜C、薄い灰色のバー)。特に、6個のVEGF−Aを標的とするTALE−活性化因子のうちの5個、および、miR−302/367クラスターを標的とする5個の活性化因子のうちの4個は、ヒト形質転換293および初代BJ繊維芽細胞それぞれで、それらの標的遺伝子の発現を5倍以上増加させた(図2aおよび2b)。本発明者の実験に用いた293細胞において、NTF3 mRNAがほとんど検知不可能なレベルで発現するので、この遺伝子を標的とするタンパク質の活性化倍数値を確実に定量化することができなかったが、最も弱い活性化因子でさえ約1000倍の発現の増加を誘導した(図2c)。面白いことに、VP64をNF−KB p65活性化ドメインと交換すると、15個の機能的な活性化因子すべてに対する活性化が減少した(図2A〜C、より暗い灰色のバー)。これらの結果は、16.5〜17.5の反復からなるVP64 TALE−活性化因子が、限定的な標的ガイドラインに従う必要なく内在性のヒト遺伝子(非コーディングmiRNA遺伝子を含む)の発現を強く活性化させることができること、およびVP64 TALE−活性化因子が一般に、NF−KB p65 TALE−活性化因子より強い促進作用を持つことを示している。
現在のプラットホームが基本的にどんな遺伝子に対してでも強く複数の高活性なTALE−活性化因子を生成する能力を示すので、次の実験を行い、これらのタンパク質が相乗的に機能することもできるかどうか判定した。複数のタンパク質の存在下で観察された活性化倍数が個々のタンパク質の相加作用より高いならば、活性化因子は相乗的に機能すると言われる。真核生物の天然に存在する活性化因子は、相乗的に機能し(Carey, M. et al. Nature 345, 361-364 (1990))、この特性を利用して転写の組み合わせと段階的な制御の両方が可能になる。TALE−活性化因子も相乗的に作用する可能性があるかどうか調べるために、5個のVP64または5個のp65 TALE−活性化因子の組み合わせを、miR−302/267クラスターおよびNTF3遺伝子の活性化について試験した。試験したすべての組み合わせについて、複数の活性化因子の発現は、結果としてmiR−302/367およびNTF3遺伝子の転写を実質的に高めた(図2bおよび2c)。相乗的活性化は、miR−302/367クラスター上のVP64およびp65活性化因子で(図2b)、ならびにNTF3遺伝子上のp65活性化因子で観察された(図2c)。したがって、VP64およびp65 TALE−活性化因子の両者は、相乗的に機能して、内在性のヒト遺伝子の発現を増加することができ、このメカニズムを使用して個々の活性化因子で達成されるよりも、さらに大きな活性化水準を誘導することができる。
参考文献
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20. Rosenbloom, K.R. et al. ENCODE whole-genome data in the UCSC Genome Browser: update 2012. Nucleic Acids Res 40, D912-917 (2012).
他の実施形態
本発明がその詳しい説明とともに記載される一方で、前述の記載は例証的で、本発明の範囲を限定しないことを意図し、それは添付の特許請求の範囲の請求範囲によって定義されることを理解されたい。その他の態様、利点および修正は、次の特許請求の範囲の範囲内である。
101 標的遺伝子に関連した情報を受け取るためのユーザ入力機構を含むユーザインタフェースを、ユーザ装置に表示させる情報を提供する
102 ユーザ装置から、選択された標的遺伝子を受け取る
103 1つまたは複数のコンピュータによって、標的遺伝子配列の1つまたは複数の部分配列を同定する
104 1つまたは複数の部分配列を選択する
105 選択された1つまたは複数の部分配列の少なくとも一部を、ユーザ装置に表示させる情報を提供する
900 コンピュータ装置、計算装置
902 プロセッサ
904 メモリ
906 記憶装置
908 高速インタフェース、高速制御装置
910 高速拡張ポート
912 低速インタフェース、低速制御装置
914 低速バス
916 ディスプレイ
920 標準規格サーバ
922 ラップトップコンピュータ
924 ラックサーバシステム
950 モバイル計算装置
952 プロセッサ
954 ディスプレイ
956 ディスプレイインタフェース
958 制御インタフェース
960 音声コーデック
962 外部インタフェース
964 メモリ
966 通信インタフェース
968 トランシーバ
970 全地球測位システムGPSレシーバモジュール
972 拡張インタフェース
974 拡張メモリ
980 携帯電話
982 スマートフォン



  1. キサントモナス属(Xanthomonas)由来の転写活性化因子様エフェクター(TALE)活性化因子結合部位の候補を同定する方法であって、
    標的遺伝子を選択するステップと、
    標的遺伝子配列の1つまたは複数の部分配列を同定するステップであって、
    前記部分配列は、前記標的遺伝子の制御領域内にあり、
    前記部分配列は、前記標的遺伝子の前記制御領域のDNaseI高感受性領域内にあり、
    前記部分配列は、18〜24個のヌクレオチドの長さであり、
    任意選択で、前記部分配列の1番目(5’)のヌクレオチドはチミンであるステップと、
    TALE−活性化因子結合部位の候補として、前記1つまたは複数の部分配列を選択するステップとを含む方法。

  2. 標的遺伝子の転写を増加させるTALE−活性化因子を作製する方法であって、
    標的遺伝子を選択するステップと、
    標的遺伝子配列の1つまたは複数の部分配列を同定するステップであって、
    前記部分配列は、前記標的遺伝子の制御領域内にあり、
    前記部分配列は、前記標的遺伝子の前記制御領域のDNaseI高感受性領域内にあり、
    前記部分配列は、18〜24個のヌクレオチドの長さで、好ましくは18個のヌクレオチドの長さであり、
    任意選択で、前記部分配列の1番目(5’)のヌクレオチドはチミンであるステップと、
    部分配列を選択するステップと、
    改変された転写活性化因子様エフェクター(TALE)反復アレイを含み、前記選択された部分配列と特異的に結合する、改変されたDNA結合ドメインと、
    標的遺伝子の転写を増加させる配列を含むトランス活性化ドメインと
    を含む融合タンパク質を生成するステップとを含み、
    それによって、前記標的遺伝子の転写を増加させるTALE−活性化因子を作製する、方法。

  3. 前記TALE反復アレイが16.5〜22.5反復である、請求項2に記載の方法。

  4. トランス活性化ドメインがVP16、VP64またはNF−KB p65ドメイン、好ましくはVP64を含む、請求項2に記載の方法。

  5. 1つまたは複数の処理装置によって実行されるコンピュータ実装方法であって、
    ユーザ装置に、標的遺伝子に関連した情報を受け取るためのユーザ入力機構を含むユーザインタフェースを表示させる情報を提供するステップと、
    前記ユーザ装置から、選択された標的遺伝子を受け取るステップと、
    1つまたは複数のコンピュータによって、標的遺伝子配列の1つまたは複数の部分配列を同定するステップであって、
    前記部分配列は、前記標的遺伝子の制御領域内にあり、
    前記部分配列は、前記標的遺伝子の前記制御領域のDNaseI高感受性領域内にあり、
    前記部分配列は、18〜24個のヌクレオチドの長さであり、
    任意選択で、前記部分配列の1番目(5’)のヌクレオチドはチミンであるステップと、
    前記1つまたは複数の部分配列を選択するステップと、
    前記ユーザ装置に、前記選択された1つまたは複数の部分配列の少なくとも一部を表示させる情報を提供するステップとを含む方法。

  6. 細胞内で標的配列の転写を増加させる方法であって、前記細胞を、請求項3から5のいずれかに記載の方法によって作製されたTALE−活性化因子に接触させることを含む方法。

  7. 細胞内で標的配列の転写を増加させる方法であって、前記細胞を、請求項3から5のいずれかに記載の方法によって作製された2つ以上のTALE−活性化因子に接触させることを含む方法。

  8. 前記2つ以上のTALE−活性化因子のうちの少なくとも1つがVP64を含み、前記2つ以上のTALE−活性化因子のうちの少なくとも1つがNF−KB p65ドメインを含む、請求項7に記載の方法。

  9. 前記標的遺伝子がコーディング遺伝子または非コーディング遺伝子である、請求項1から5のいずれかに記載の方法。

  10. 前記非コーディング遺伝子がmiRNAである、請求項9に記載の方法。

  11. 前記標的遺伝子の前記制御領域がプロモーター領域である、請求項1から5のいずれかに記載の方法。

 

 

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