組換えファージ及び細菌検出方法

 

標的細菌を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態において、該方法は、1セットの標的細菌を感染することができるファージに試料を曝露することを含み、マーカーをコードする異種性核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、標的細菌はリステリアを含む。いくつかの実施形態において、標的細菌は全てリステリアである。さらに、マーカーをコードする異種性核酸配列を含む組換えリステリアファージが提供され、特に、このようなファージの組み合わせ、及びこのようなファージを含む製品は有用である。

 

 

関連出願
本願は2013年3月27日に出願された米国仮特許出願番号第61/805917号の優先権と利益を主張し、その内容の全体を本明細書に援用する。
序論
細菌の汚染混入と感染は公衆衛生及び他の多くの領域における重大な問題である。それ故、医療、獣医療、農業、食品加工、工業及び他の状況において細菌を検出するための方法と試薬が有益である。実際に、年間の世界中の細菌インビトロ診断市場は100億ドルを超えている。
食物媒介性細菌性疾患は人間の健康に対して重大な脅威をもたらしており、米国において年間に約7600万件もの疾病例、325,000件もの入院例、及び5,000件もの死亡例の原因になっていると推定されている。
例えば、1996年にあるジュース製造会社により大腸菌が混入したジュースが一般に発売され、1人が死亡し、66人が病気になった。その会社は150万ドルの罰金を支払い、リコールだけで650万ドルの費用をその会社に負わせた。2006年にはカリフォルニア州が起源の汚染されたホウレンソウに由来する大腸菌O157:H7の大発生により205人が病気になり、3人が死亡した。2011年には7月、8月、及び9月にコロラド州が起源のカンタロープメロンに由来するリステリア症の大発生により30人が死亡した。それは米国疾病管理予防センターが1970年代に伝染病の大発生の追跡を開始して以来、死亡数に関して2番目に致命的と記録された米国での伝染病の大発生である。2012年の別のカンタロープメロンのリコールからその食物供給品は未だに安全ではないことが示唆され、汚染混入を特定するためにその食物供給品を検査する追加の方法と試薬の一般的で広範な必要性が強調されている。
別の例はウシの乳房の炎症、牛乳生産量の減少、及び牛乳の品質の低下を引き起こす細菌細胞が原因の感染症である牛乳房炎である。この病状は細菌である黄色ブドウ球菌とスタフィロコッカス・アガラクティア(Staphylococcus agalactiae)によって引き起こされる。西洋世界におけるこの牛乳生産量の減少と品質の低下だけで年間に37億ドルの財政的損失の原因になると示唆されている。
別の例は世界中で財政的損失の原因となる細菌である牛結核菌(Mycobacterium bovis)である。例えば、2005年にはミシガン州の小さな牧場で55頭の牛からなる群れのうちの12頭の牛が牛結核について陽性と検査された。その牧場は強制的に全ての群れの牛と全ての群れの豚を処分させられた。牛の結核検査は動物が2日間にわたって収容されることを必要とし、検査は5%の確率で偽陽性である。多くの場合に全ての群れが隔離又は処分される必要がある。年間の世界中の財政的損失は30億ドルと推定されている。
結核は世界中の死亡例の主因である。世界人口の三分の一が結核を引き起こす細菌である結核菌に感染している。毎日25,000人の人々が感染し、5,000人の人々がその疾患のために死亡する。さらに、主に不充分な診断のために結核菌の多剤耐性株が出現しつつあり、世界的な流行病の発生としての結核の再興が現実的な脅威となっている。結核診断薬の年間の世界中の市場は18億ドルと推定されている。
MRSAは一般的な細菌である黄色ブドウ球菌の薬剤耐性型であり、米国では250万人の人々によって保有されている。MRSA細菌の性質のため、保有者は健康な個体であり得、それでもやはり非常に伝染性であり得る。その細菌は非常に伝染性であり、接触によって広まる。全ての感染例の約86%が病院内において生じており、これらの感染例は20%の死亡率を有している。この細菌は治療するのに標準的な費用よりも平均して21,000ドルの費用がかかり、米国において年間に約19,000人の人々を殺している。
リステリア・モノサイトゲネスはヒトと動物において侵襲性疾患を引き起こし得る細胞内病原体である。ヒトリステリア症感染例の約99%が食物媒介性のようである。リステリア・モノサイトゲネスは様々な生鮮食品及び加工食品から単離されているが、大半のヒトリステリア症感染例がこの病原体の汚染混入後の増殖を許すRTE食品の消費によって引き起こされているようである。リステリア症は米国における年間約500件の死亡例の原因であると推定されており、公知の食物媒介性病原体に起因する年間の死亡例の28%を占め、サルモネラ感染症が原因の死亡例に次いで第2位である。
微生物汚染混入を検出するための方法とシステムが存在する。そのような方法とシステムは、汚染された可能性がある試料をその試料が収集される環境から取り出し、検査室環境にその試料を移し、そこで数時間から数日の範囲の長期の時間にわたる濃縮と増殖のために培養環境にその試料が置かれる必要があるといったことをはじめとする多くの欠点に悩まされている。さらに、これらの検査室はしばしば現場から遠く離れた所にあるので多くの場合に検査室への試料の輸送に遅れがでる。一旦濃縮されると、高価な装置、伝統的な培養方法、PCR及び他の方法を用いて試料が分析されるのが典型的である。したがって、現行の過程は多くの場合に試料抽出と結果との間に大きな時間のずれを含み、その時間の間に試料抽出された条件が変化したかもしれず、例えば、患者の感染症を診断するために、又は製造された多くの食品の汚染混入に対処するためにそのアッセイの結果を利用することができない。したがって、新しい検査法と試薬が有用である。
ファージは細菌と古細菌をファージ自身の複製手段として使用する自然界で進化したウイルスである。ファージは自身を宿主微生物に結合し、自身の遺伝物質を宿主に注入することにより複製を行い、その宿主細胞にそのファージを数十倍から数千倍まで複製させる。溶菌ファージと呼ばれる幾つかのファージは宿主微生物を破裂させ、それにより他の微生物を探すために子孫ファージを環境中に放出する。親ファージによる微生物の感染、子孫ファージを産生するための微生物中でのファージの繁殖(増加)、及び溶菌後の子孫ファージの放出についての総ファージ複製時間はファージ、微生物、及び環境条件に応じて数分ほどの短い時間であり得る。
ファージが感染する細菌の存在を示すためにそのファージを使用する方法のことが記載されている。これらの方法では細菌を含む試料がその細菌に特異的なファージと共に培養される。そのファージはその細菌に感染し、その中で複製して測定可能な信号を生じる。検出及び特定の手段として感染した細菌から放出された子孫ファージの検出を活用する方法もある。そのような方法では親ファージが細菌への感染に成功しなければ子孫ファージは産生されない。さらに他の方法はファージ全体よりもファージ遺伝子産物の検出に依存している。例えば、ファージが宿主細菌への感染に成功するとルシフェラーゼを産生するルシフェラーゼレポーターファージのことが記載されている。次にそのルシフェラーゼによって、検出されると試料中の宿主細菌の存在を表す光が作り出される。他の方法は特定のバクテリオファージによる宿主細菌の溶菌性感染の成功の後に放出される細菌破片の検出に依存している。遺伝子操作ファージによりコードされる異種性遺伝子産物を検出する方法を細菌診断薬に使用することができるという示唆にもかかわらず、細菌の汚染混入を検出する検査室外設定ではその技術は未だに用いられていない。
種と亜種の両方のレベルで細菌の汚染混入を特定し、追跡する能力が流行株を追跡し、多くの他の設定の中でも食品加工工場内及び最終製品内の汚染混入についての疫学データを収集する手段としてますます重要になっている。種レベルでの細菌株の特定は主に生化学的証拠に基づいている。亜種の決定はあまり定義されておらず、統一的な決定方法は存在しない。亜種の決定には複数の方法が存在するが、4つの方法、すなわち、血清型分類、ファージ型分類、パルスフィールドゲル電気泳動、及びリボタイピングが共通して用いられている。これらの4つの方法は全て制約に悩まされており、各システムで下位群内の特定の種を分類することができるが、この分類は必ずしもその下位群の全てのメンバーが構成メンバー内の特徴を共有することを保証するわけではない。
ファージベース細菌検出方法の特異度と感度は部分的には遺伝子操作バクテリオファージの宿主範囲によって決定される。ファージベース細菌検出システムの有用性は、その方法に使用されるファージの所定の宿主範囲の存在をはじめとする幾つかの要因に依存する。本開示は標的微生物セットを限定する所定の宿主範囲を有する遺伝子操作ファージを提供することによりこれらの必要性と他の必要性を満たす。本開示は標的微生物の宿主範囲を共に限定する遺伝子操作ファージセットも提供する。その遺伝子操作ファージとそれらのファージセットは、例えば、標的微生物を検出する方法において有用である。本開示のこれらの態様及び他の態様を提供する。
第1の態様では本開示は標的微生物を検出する方法を提供する。その微生物は古細菌又は細菌であり得る。
ある特定の実施形態では本方法は試料を提供すること、第1セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第1マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第1の種類のファージに前記試料を曝露すること、第2セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第2マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第2の種類のファージに前記試料を曝露すること、及びその曝露された試料の中の第1マーカーと第2マーカーの存在についてアッセイすることを含む。幾つかの実施形態では前記試料中の第1マーカーの検出はその試料中の標的細菌の第1セットの細菌の存在を表す。幾つかの実施形態では前記試料中の第2マーカーの検出はその試料中の標的細菌の第2セットの細菌の存在を表す。幾つかの実施形態では第1マーカーと第2マーカーは同じであり、前記試料中のそのマーカーの検出はその試料中の第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌のうちの少なくとも一方の細菌の存在を表す。
幾つかの実施形態では第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌は独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも2種を含む。幾つかの実施形態では第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌は独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも3種を含む。幾つかの実施形態では第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌は独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも4種を含む。幾つかの実施形態ではその一つの属の細菌はリステリアである。幾つかの実施形態では第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌は共通して少なくとも1種の細菌を含む。幾つかの実施形態では第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌は共通して少なくとも2種の細菌を含む。幾つかの実施形態では第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌は共通して少なくとも3種の細菌を含む。幾つかの実施形態では第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌は共通して少なくとも4種の細菌を含む。幾つかの実施形態ではそのリステリア属の種はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ(Listeria marthii)、リステリア・ロコウルティ(Listeria rocourti)及びリステリア・ウェルシメリから選択される。幾つかの実施形態ではそのリステリア属の種はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択される。
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュアの11、22、37、及び56から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュアの少なくとも4種類の対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態ではリステリア・イノキュアのそれらの少なくとも4種類の対立遺伝子型は11、22、37、及び56である。
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスのDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dから選択される少なくとも1種類のリボタイプを備える。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスの少なくとも19種類のリボタイプを備える。幾つかの実施形態ではリステリア・モノサイトゲネスのそれらの少なくとも19種類のリボタイプはDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dである。
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・ゼーリゲリの3、20、24、及び35から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・ゼーリゲリの少なくとも4種類の対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態ではリステリア・ゼーリゲリのそれらの少なくとも4種類の対立遺伝子型は3、20、24、及び35である。
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・ウェルシメリの15、27、32、及び89から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・ウェルシメリの少なくとも4種類の対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態ではリステリア・ウェルシメリのそれらの少なくとも4種類の対立遺伝子型は15、27、32、及び89である。
幾つかの実施形態では第1セットの標的細菌は同じ属の全てのメンバーである。幾つかの実施形態では第2セットの標的細菌は同じ属の全てのメンバーである。幾つかの実施形態では標的細菌は1つより多くの属のメンバーを含む。幾つかの実施形態では標的細菌の全てがリステリアである。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム(Enterococcus faceium)、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス(Kocuria varians)、クルチア・ギブソニイ(Kurthia gibsonii)、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス(Streptococcus galloyticus)、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス(Lactobacillus lactus)、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス(Micrococcus lutues)、シュードモナス・プロトジェンス(Pseudomonas protogens)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科のうちの少なくとも1つが含まれない。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム(Enterococcus faceium)、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス(Kocuria varians)、クルチア・ギブソニイ(Kurthia gibsonii)、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス(Streptococcus galloyticus)、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス(Lactobacillus lactus)、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス(Micrococcus lutues)、シュードモナス・プロトジェンス(Pseudomonas protogens)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科が含まれない。
幾つかの実施形態では本方法は、第3セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第3マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第3の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第4セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第4マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第4の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第5セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第5マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第5の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第6セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第6マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第6の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第7セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第7マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第7の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第8セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第8マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第8の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第9セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第9マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第9の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、10以上のセットの標的細菌に感染することができ、且つ、10以上のマーカーをコードする異種性核酸配列を備える10以上の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。3種類以上のファージを利用する幾つかの実施形態ではそれらの3種類以上のマーカーの全てが異なる。3種類以上のファージを利用する幾つかの実施形態ではそれらの3種類以上のマーカーの全てが同じである。3種類以上のファージを利用する幾つかの実施形態ではそれらのマーカーのうちの2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、又は9種類が同じである。
幾つかの実施形態では本方法において使用される少なくとも1種類のファージがA511、P100、LP40、LP44、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125、及びLP143、及びそれらの派生株から選択される。幾つかの実施形態では本方法において使用される全ての種類のファージがA511、P100、LP40、LP44、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125、及びLP143、及びそれらの派生株から選択される。
幾つかの実施形態では第1マーカーはスクリーニング可能なマーカーである。幾つかの実施形態では第1マーカーはルシフェラーゼである。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号2に対して少なくとも70%同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号4に対して少なくとも70%同一である。
幾つかの実施形態では第1の種類のファージはLP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、及びP100::ffluc、及びそれらのファージの派生株から選択される。幾つかの実施形態では第1の種類のファージはLP40:nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc、及びP100::nlucから選択される。
幾つかの実施形態では第2マーカーはスクリーニング可能なマーカーである。幾つかの実施形態では第2マーカーはルシフェラーゼである。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号2に対して少なくとも70%同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号4に対して少なくとも70%同一である。
幾つかの実施形態では第2の種類のファージはLP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、及びP100::fflucから選択される。幾つかの実施形態では第2の種類のファージはLP40:nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc、及びP100::nlucから選択される。
幾つかの実施形態では本方法は前記試料をA511::nluc、P100::nluc、及びLP124::nlucと接触させることを含む。幾つかの実施形態では本方法は前記試料をA511::nluc及びLP124::nlucと接触させることを含む。幾つかの実施形態では本方法は前記試料をA511::nluc、LP40::nluc、及びLP124::nlucと接触させることを含む。
幾つかの実施形態では本方法は第1の種類のファージと第2の種類のファージに対して前記試料を同時に曝露することを含む。
幾つかの実施形態では前記試料は環境試料である。
幾つかの実施形態では第1マーカーが前記試料中に検出され、その試料中の標的細菌の第1セットの細菌の存在を表す。幾つかの実施形態では第2マーカーが前記試料中に検出され、その試料中の標的細菌の第2セットの細菌の存在を表す。幾つかの実施形態では第1マーカーと第2マーカーは同じであり、そのマーカーが前記試料中に検出され、その試料中の第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌のうちの少なくとも一方の細菌の存在を表す。
幾つかの実施形態では環境試料に対するそのアッセイの偽陽性率は5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下である。幾つかの実施形態では環境試料に対するそのアッセイの偽陰性率は5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下である。
幾つかの実施形態では前記試料は前記ファージに曝露される前に代謝促進条件に曝露される。
幾つかの実施形態では本方法は、標的細菌に感染することができる前記ファージに前記試料を曝露する前の一時期に前記試料を代謝促進条件下でインキュベートすることをさらに含む。
ある特定の実施形態では本方法は試料を提供すること、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも1種類の組換えリステリアファージであって、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される前記組換えリステリアファージに前記試料を曝露すること、及びその曝露された試料の中の前記マーカーの存在についてアッセイすることを含む。幾つかの実施形態では本方法は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも1種類の組換えリステリアファージであって、組換えA511と組換えP100から選択される前記組換えリステリアファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では前記試料中の前記マーカーの検出はその試料の中のリステリアの存在を表す。
幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ(Listeria marthii)、リステリア・ロコウルティ(Listeria rocourti)、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも1つの種を含む。幾つかの実施形態では前記試料中の前記マーカーの検出は、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ(Listeria marthii)、リステリア・ロコウルティ(Listeria rocourti)、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも1つの種のその試料における存在を表す。
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも1つの種を含む。幾つかの実施形態では前記試料中の前記マーカーの検出は、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも1つの種のその試料における存在を表す。
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュアの11、22、37、及び56から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備え、前記試料中の前記マーカーの検出はリステリア・イノキュアの11、22、37、及び56から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型の存在を表す。幾つかの実施形態では前記少なくとも1種類のリステリアファージはリステリア・イノキュアsigB対立遺伝子型11、22、37、及び56に感染することができる。
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスのDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dから選択される少なくとも1種類のリボタイプを備え、前記試料中の前記マーカーの検出はリステリア・モノサイトゲネスのDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dから選択される少なくとも1種類のリボタイプの存在を表す。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスのリボタイプDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dを含む。
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ゼーリゲリの3、20、24、及び35から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備え、前記試料中の前記マーカーの検出はリステリア・ゼーリゲリの3、20、24、及び35から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型の存在を表す。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ゼーリゲリsigB対立遺伝子型3、20、24、及び35を含む。
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ウェルシメリの15、27、32、及び89から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備え、前記試料中の前記マーカーの検出はリステリア・ウェルシメリの15、27、32、及び89から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型の存在を表す。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ウェルシメリsigB対立遺伝子型15、27、32及び89を含む。
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも2つの種を含む。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも3つの種を含む。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ(Listeria marthii)、リステリア・ロコウルティ(Listeria rocourti)、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも4つの種を含む。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム(Enterococcus faceium)、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス(Kocuria varians)、クルチア・ギブソニイ(Kurthia gibsonii)、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス(Streptococcus galloyticus)、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス(Lactobacillus lactus)、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス(Micrococcus lutues)、シュードモナス・プロトジェンス(Pseudomonas protogens)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科のうちの少なくとも1つが含まれない。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム(Enterococcus faceium)、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス(Kocuria varians)、クルチア・ギブソニイ(Kurthia gibsonii)、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス(Streptococcus galloyticus)、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス(Lactobacillus lactus)、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス(Micrococcus lutues)、シュードモナス・プロトジェンス(Pseudomonas protogens)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科が含まれない。幾つかの実施形態では標的細菌の全てがリステリアである。
幾つかの実施形態では前記マーカーはスクリーニング可能なマーカーである。幾つかの実施形態では前記マーカーはルシフェラーゼである。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号2に対して少なくとも70%同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号4に対して少なくとも70%同一である。幾つかの実施形態では前記ファージはLP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、及びP100::fflucから選択される。幾つかの実施形態では前記ファージはLP40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc、及びP100::nlucから選択される。
幾つかの実施形態では前記試料は環境試料である。
幾つかの実施形態では前記マーカーが前記試料中に検出され、前記試料中の標的細菌の第1セットの細菌の存在を表す。
幾つかの実施形態では環境試料に対するそのアッセイの偽陽性率は5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下である。幾つかの実施形態では環境試料に対するそのアッセイの偽陰性率は5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下である。幾つかの実施形態では前記試料は前記ファージに曝露される前に代謝促進条件に曝露される。
別の態様では本開示はマーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージを提供する。幾つかの実施形態ではその組換えリステリアファージは組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される。幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ(Listeria marthii)、リステリア・ロコウルティ(Listeria rocourti)、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも1つの種を含む。幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも1つの種を含む。
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュアの11、22、37、及び56から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備え、前記マーカーを産生する。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュアsigB対立遺伝子型11、22、37、及び56を含む。
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスのDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dから選択される少なくとも1種類のリボタイプを備える。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスのリボタイプDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dを含む。
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ゼーリゲリの3、20、24、及び35から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ゼーリゲリsigB対立遺伝子型3、20、24、及び35を含む。
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ウェルシメリの15、27、32、及び89から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ウェルシメリsigB対立遺伝子型15、27、32及び89を含む。
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ(Listeria marthii)、リステリア・ロコウルティ(Listeria rocourti)、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも2つの種を含む。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ(Listeria marthii)、リステリア・ロコウルティ(Listeria rocourti)、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも3つの種を含む。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ(Listeria marthii)、リステリア・ロコウルティ(Listeria rocourti)、及びリステリア・ウェルシメリを含む。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム(Enterococcus faceium)、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス(Kocuria varians)、クルチア・ギブソニイ(Kurthia gibsonii)、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス(Streptococcus galloyticus)、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス(Lactobacillus lactus)、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス(Micrococcus lutues)、シュードモナス・プロトジェンス(Pseudomonas protogens)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科のうちの少なくとも1つが含まれない。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム(Enterococcus faceium)、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス(Kocuria varians)、クルチア・ギブソニイ(Kurthia gibsonii)、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス(Streptococcus galloyticus)、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス(Lactobacillus lactus)、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス(Micrococcus lutues)、シュードモナス・プロトジェンス(Pseudomonas protogens)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科が含まれない。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌の全てがリステリアである。
幾つかの実施形態では前記マーカーはスクリーニング可能なマーカーである。幾つかの実施形態では前記マーカーはルシフェラーゼである。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号2に対して少なくとも70%同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号4に対して少なくとも70%同一である。
幾つかの実施形態では前記ファージはLP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、及びLP143::fflucから選択される。幾つかの実施形態では前記ファージはLP124::nluc及びLP125::nlucから選択される。
幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージは配列番号2に対して少なくとも70%同一であるルシフェラーゼをコードする異種性核酸配列を備え、前記組換えリステリアファージは組換えA511及びその派生株、組換えP100及びその派生株、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される。幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージはLP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、及びP100::fflucから選択される。
幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージは配列番号4に対して少なくとも70%同一であるルシフェラーゼをコードする異種性核酸配列を備え、前記組換えリステリアファージは組換えA511及びその派生株、組換えP100及びその派生株、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される。幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージはLP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc、及びP100::nlucから選択される。
幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージは5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下の偽陽性率で環境試料中に標的細菌を検出する。幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージは5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下の偽陰性率で環境試料中に標的細菌を検出する。
別の態様では本開示は組換えリステリアファージを含む組成物を提供する。幾つかの実施形態ではその組成物は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも1種類の組換えリステリアファージであって、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される前記組換えリステリアファージ、及びa)炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも1種類の化合物、b)少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、c)少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、d)少なくとも脂質から選択される化合物、e)少なくとも1種類の無機化合物、及びf)少なくとも1種類の有機化合物のうちの少なくとも1つから選択される少なくとも1種類の非ファージ性成分を含む。幾つかの実施形態ではその組成物は1,2−プロパンジオール、2−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、b−フェニルエチルアミン、L−アスパラギン酸、L−プロリン、D−アラニン、D−セリン、L−グルタミン酸、L−アスパラギン、D−アスパラギン酸、L−グルタミン、Gly−Asp、D−トレオニン、Gly−Glu、L−セリン、L−トレオニン、L−アラニン、Ala−Gly、Gly−Pro、L−アラビノース、N−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトース、D−トレハロース、D−マンノース、ズルシトール、D−ソルビトール、グリセロール、L−フコース、D,L−a−グリセロール、ホスフェート、D−キシロース、D−マンニトール、D−グルコース−6−リン酸、D−リボース、L−ラムノース、D−フルクトース、a−D−グルコース、マルトース、D−メリビオース、チミジン、a−メチル−D−ガラクトシド、a−D−ラクトース、ラクツロセム(lactulosem) ショ糖、ウリジン、D−グルコース−1−リン酸、D−フルクトース−6−リン酸、b−メチル−D−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、2’−デオキシアデノシン、アデノシン、m−イノシトール、D−セロビオース、イノシン、N−アセチル−D−マンノサミン、D−プシコース、L−リキソース、D−サッカリン酸、コハク酸、D−グルクロン酸、D−グルコン酸、D,L−乳酸、ギ酸、D−ガラクトン酸−g−ラクトン、D,L−リンゴ酸、酢酸、D−グルコサミン酸、a−ケトグルタル酸、a−ケト酪酸、m−酒石酸、a−ヒドロキシグルタル酸−g−ラクトン、a−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、D−リンゴ酸、L−リンゴ酸、p−ヒドロキシフェニル酢酸、m−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、L−ガラクトン酸−g−ラクトン、D−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン20、ツイーン40、ツイーン80のうちの少なくとも1つを含む。幾つかの実施形態ではその組成物はA511::nluc、P100::nluc、及びLP124::nlucを含む。幾つかの実施形態ではその組成物はA511::nluc及びLP124::nlucを含む。幾つかの実施形態ではその組成物はA511::nluc、LP40::nluc、及びLP124::nlucを含む。
幾つかの実施形態では前記組成物は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも2種類の組換えリステリアファージであって、組換えA511及びその派生株、組換えP100及びその派生株、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される前記組換えリステリアファージを含む。幾つかの実施形態では前記組成物は、a)炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも1種類の化合物、b)少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、c)少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、d)少なくとも脂質から選択される化合物、e)少なくとも1種類の無機化合物、及びf)少なくとも1種類の有機化合物のうちの少なくとも1つから選択される少なくとも1種類の非ファージ性成分をさらに含む。幾つかの実施形態ではその組成物は1,2−プロパンジオール、2−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、b−フェニルエチルアミン、L−アスパラギン酸、L−プロリン、D−アラニン、D−セリン、L−グルタミン酸、L−アスパラギン、D−アスパラギン酸、L−グルタミン、Gly−Asp、D−トレオニン、Gly−Glu、L−セリン、L−トレオニン、L−アラニン、Ala−Gly、Gly−Pro、L−アラビノース、N−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトース、D−トレハロース、D−マンノース、ズルシトール、D−ソルビトール、グリセロール、L−フコース、D,L−a−グリセロール、ホスフェート、D−キシロース、D−マンニトール、D−グルコース−6−リン酸、D−リボース、L−ラムノース、D−フルクトース、a−D−グルコース、マルトース、D−メリビオース、チミジン、a−メチル−D−ガラクトシド、a−D−ラクトース、ラクツロセム(lactulosem) ショ糖、ウリジン、D−グルコース−1−リン酸、D−フルクトース−6−リン酸、b−メチル−D−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、2’−デオキシアデノシン、アデノシン、m−イノシトール、D−セロビオース、イノシン、N−アセチル−D−マンノサミン、D−プシコース、L−リキソース、D−サッカリン酸、コハク酸、D−グルクロン酸、D−グルコン酸、D,L−乳酸、ギ酸、D−ガラクトン酸−g−ラクトン、D,L−リンゴ酸、酢酸、D−グルコサミン酸、a−ケトグルタル酸、a−ケト酪酸、m−酒石酸、a−ヒドロキシグルタル酸−g−ラクトン、a−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、D−リンゴ酸、L−リンゴ酸、p−ヒドロキシフェニル酢酸、m−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、L−ガラクトン酸−g−ラクトン、D−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン20、ツイーン40、ツイーン80のうちの少なくとも1つを含む。
別の態様では本開示は製品を提供する。幾つかの実施形態ではその製品は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも1種類の組換えリステリアファージであって、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される前記組換えリステリアファージ、及びa)炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも1種類の化合物、b)少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、c)少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、d)少なくとも脂質から選択される化合物、e)少なくとも1種類の無機化合物、及びf)少なくとも1種類の有機化合物のうちの少なくとも1つから選択される少なくとも1種類の非ファージ性成分を含む溶液を備える。幾つかの実施形態では前記製品は、1,2−プロパンジオール、2−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、b−フェニルエチルアミン、L−アスパラギン酸、L−プロリン、D−アラニン、D−セリン、L−グルタミン酸、L−アスパラギン、D−アスパラギン酸、L−グルタミン、Gly−Asp、D−トレオニン、Gly−Glu、L−セリン、L−トレオニン、L−アラニン、Ala−Gly、Gly−Pro、L−アラビノース、N−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトース、D−トレハロース、D−マンノース、ズルシトール、D−ソルビトール、グリセロール、L−フコース、D,L−a−グリセロール、ホスフェート、D−キシロース、D−マンニトール、D−グルコース−6−リン酸、D−リボース、L−ラムノース、D−フルクトース、a−D−グルコース、マルトース、D−メリビオース、チミジン、a−メチル−D−ガラクトシド、a−D−ラクトース、ラクツロセム(lactulosem) ショ糖、ウリジン、D−グルコース−1−リン酸、D−フルクトース−6−リン酸、b−メチル−D−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、2’−デオキシアデノシン、アデノシン、m−イノシトール、D−セロビオース、イノシン、N−アセチル−D−マンノサミン、D−プシコース、L−リキソース、D−サッカリン酸、コハク酸、D−グルクロン酸、D−グルコン酸、D,L−乳酸、ギ酸、D−ガラクトン酸−g−ラクトン、D,L−リンゴ酸、酢酸、D−グルコサミン酸、a−ケトグルタル酸、a−ケト酪酸、m−酒石酸、a−ヒドロキシグルタル酸−g−ラクトン、a−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、D−リンゴ酸、L−リンゴ酸、p−ヒドロキシフェニル酢酸、m−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、L−ガラクトン酸−g−ラクトン、D−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン20、ツイーン40、ツイーン80のうちの少なくとも1つを含む溶液を備える容器を含む。幾つかの実施形態では前記製品はA511::nluc、P100::nluc、及びLP124::nlucを含む。幾つかの実施形態では前記製品はA511::nluc及びLP124::nlucを含む。幾つかの実施形態では前記製品はA511::nluc、LP40::nluc、及びLP124::nlucを含む。
幾つかの実施形態では前記製品は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも2種類の組換えリステリアファージであって、組換えA511及びその派生株、組換えP100及びその派生株、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される前記組換えリステリアファージ、及び、a)炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも1種類の化合物、b)少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、c)少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、d)少なくとも脂質から選択される化合物、e)少なくとも1種類の無機化合物、及びf)少なくとも1種類の有機化合物のうちの少なくとも1つから選択される少なくとも1種類の非ファージ性成分を含む溶液を備える。幾つかの実施形態では前記製品は、1,2−プロパンジオール、2−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、b−フェニルエチルアミン、L−アスパラギン酸、L−プロリン、D−アラニン、D−セリン、L−グルタミン酸、L−アスパラギン、D−アスパラギン酸、L−グルタミン、Gly−Asp、D−トレオニン、Gly−Glu、L−セリン、L−トレオニン、L−アラニン、Ala−Gly、Gly−Pro、L−アラビノース、N−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトース、D−トレハロース、D−マンノース、ズルシトール、D−ソルビトール、グリセロール、L−フコース、D,L−a−グリセロール、ホスフェート、D−キシロース、D−マンニトール、D−グルコース−6−リン酸、D−リボース、L−ラムノース、D−フルクトース、a−D−グルコース、マルトース、D−メリビオース、チミジン、a−メチル−D−ガラクトシド、a−D−ラクトース、ラクツロセム(lactulosem) ショ糖、ウリジン、D−グルコース−1−リン酸、D−フルクトース−6−リン酸、b−メチル−D−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、2’−デオキシアデノシン、アデノシン、m−イノシトール、D−セロビオース、イノシン、N−アセチル−D−マンノサミン、D−プシコース、L−リキソース、D−サッカリン酸、コハク酸、D−グルクロン酸、D−グルコン酸、D,L−乳酸、ギ酸、D−ガラクトン酸−g−ラクトン、D,L−リンゴ酸、酢酸、D−グルコサミン酸、a−ケトグルタル酸、a−ケト酪酸、m−酒石酸、a−ヒドロキシグルタル酸−g−ラクトン、a−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、D−リンゴ酸、L−リンゴ酸、p−ヒドロキシフェニル酢酸、m−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、L−ガラクトン酸−g−ラクトン、D−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン20、ツイーン40、ツイーン80のうちの少なくとも1つを含む溶液を備える容器を含む。
別の態様では本開示はファージの標的微生物を特定する方法を提供する。それらの標的微生物は細菌又は古細菌であり得る。幾つかの実施形態では本方法は、異なる細菌種の複数の液体培養試料をそのファージに曝露すること、及びそのファージがそれらの複数の異なる細菌種に感染するか判定することを含む。幾つかの実施形態ではそのファージがそれらの複数の異なる細菌種に感染するか判定することはそれらの試料における細胞の透明化の測定を含む。幾つかの実施形態では試料における細胞の透明化はその試料の中の細菌種がそのファージの標的細菌であることを表す。
幾つかの実施形態では前記ファージは第1マーカーをコードする異種性核酸配列を備える。幾つかの実施形態ではそのファージがそれらの複数の異なる細菌種に感染するか判定することはそれらの複数の試料の中の前記マーカーの存在についてアッセイすることによる。幾つかの実施形態では試料中の前記マーカーの検出はその試料の中の細菌種がそのファージの標的細菌であることを表す。
cps遺伝子配列のアラインメントを示す図である。 図1に記載のcps遺伝子によりコードされるタンパク質配列のアラインメントを示す図である。 挿入されているホタルルシフェラーゼ・コード配列のアラインメントを示す図である。 挿入されているNanoLucルシフェラーゼ・コード配列のアラインメントを示す図である。
本明細書において別途定義されない限り、本開示に関連して使用されている科学用語と技術用語は当業者によって共通して理解される意味を有するものとする。さらに、文脈から別途必要とされない限り、単数形の用語は複数形のものを含み、複数形の用語は単数形のものを含むものとする。一般に、本明細書に記載される生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学及びタンパク質核酸化学、及びハイブリダイゼーションとの関連で使用される命名法、及びそれらの技術は当技術分野においてよく知られており、一般的に用いられる命名法及び技術である。本明細書において引用されるある特定の参照文献及び他の文書は参照により明示的に本明細書に援用される。さらに、本明細書において引用される全てのGenbank及び他の配列データベースの記録物はここに参照により本明細書に援用される。矛盾がある場合には定義をはじめとして本明細書が優先される。材料、方法、及び実施例は例示のみを目的としており、限定的であることを意図していない。
本開示の方法と技術は概して当技術分野においてよく知られており、且つ、別途指示されない限り本明細書を通して引用及び議論される様々な一般的参照文献及びより特定的な参照文献において記載される従来法に従って実施される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州(2001年);Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates(1992年、及び2002年に増補);Taylor及びDrickamer、Introduction to Glycobiology、Oxford Univ. Press(2003年);Worthington Enzyme Manual、Worthington Biochemical社、フリーホールド、ニュージャージー州;Handbook of Biochemistry: Section A Proteins、第I巻、CRC Press(1976年);Handbook of Biochemistry: Section A Proteins、第II巻、CRC Press(1976年);Essentials of Glycobiology、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999年)を参照されたい。ファージに適用可能な多くの分子生物学と遺伝学の技術がClokieら、Bacteriophages: Methods and Protocols、第1巻及び第2巻(Methods in Molecular Biology、第501巻及び第502巻)、Humana Press、ニューヨーク、ニューヨーク州(2009年)に記載されており、その文献をここに参照により本明細書に援用する。
本開示は、インターネット上で公開されているある特定のアミノ酸配列及び核酸配列の配列データベースエントリー(例えば、UniProt/SwissProt又はGENEBANKの記録物)、並びにインターネット上の他の情報について言及する。当業者は配列データベースエントリーをはじめとするインターネット上の情報は時々更新されること、及び、例えば、特定の配列に言及するために使用される参照番号が変わり得ることを理解する。インターネット上の配列情報又は他の情報の公開データベースに言及する場合はそのような変更が起こり得ること、及びインターネット上の特定の実施形態の情報が行き来できることが理解される。当業者はインターネット上で検索することにより同等の情報を見つけることができるので、インターネットのウェッブページのアドレス又は配列データベースのエントリーに対する言及が、問題の情報を利用できることと問題の情報が公に普及していることの証拠となる。
本ファージ、組成物、方法、及び他の実施形態を開示及び説明する前に本明細書において使用される用語法は特定の実施形態を説明することだけを目的としており、限定的であることを意図していないことが理解されるべきである。本明細書及び添付されている特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a」、「an」及び「the」は文脈から別途明確に指示されない限り複数形の指示物を含むことを留意すべきである。
本明細書において使用される場合、「含む(comprising)」という用語は「含む(including)」又は「含む(containing)」と同義であり、包括的又は開放的であり、その他の引用されていないメンバー、要素、又は方法ステップを除外しない。
本明細書において使用される場合、「インビトロ」という用語は生物(例えば、動物、植物、又は微生物)内というよりもむしろ人工的環境において、例えば、試験管又は反応容器において、細胞培養において、ペトリ皿等において生じる事象を指す。
本明細書において使用される場合、「インビボ」という用語は生物(例えば、動物、植物、又は微生物)内で生じる事象を指す。それにもかかわらず、微生物内で少なくとも部分的にインビボで生じるアッセイは、例えばそのアッセイの一部が培養中のその微生物の体外で生じる場合にはインビトロで生じ得る。
本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、(1)物質又は物体が(自然界であるにしても、実験環境にあるにしても)最初に産生されたときにその物質又は物体と結合している成分の少なくとも幾つかより分離されている、及び/又は(2)人の手によって作製、調製、及び/又は製造されているその物質又は物体を指す。単離された物質及び/又は物体は、それらの物質及び/又は物体と最初に結合している他の成分の少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、又はそれより多くの割合から分離され得る。幾つかの実施形態では単離された因子は約80%より多くの割合で、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、又は約99%より多くの割合で純粋である。本明細書において使用される場合、物質が他の成分を実質的に含んでいない場合、その物質は「純粋」である。
本明細書において使用される場合、「ペプチド」という用語は短いポリペプチド、例えば、典型的には約50アミノ酸未満のアミノ酸を含むポリペプチド、より典型的には約30アミノ酸未満のアミノ酸を含むポリペプチドを指す。本明細書において使用される場合、その用語は構造的機能を模倣し、したがって生物学的機能を模倣する類似物及び模倣物を包含する。
「ポリペプチド」という用語は天然と非天然の両方のタンパク質、並びにそれらのタンパク質の断片、突然変異体、誘導体、及び類似物を包含する。ポリペプチドは単量体性又は多量体性であり得る。さらに、ポリペプチドはそれぞれ1つ以上の明確な活性を有する様々なドメインを含み得る。疑義を回避するため、「ポリペプチド」は2アミノ酸よりも長いあらゆる長さであり得る。
「単離タンパク質」又は「単離ポリペプチド」という用語は、そのタンパク質又はポリペプチドの起源又は由来のために(1)そのタンパク質又はポリペプチドの本来の状態でそのタンパク質又はポリペプチドに付随する天然結合成分と結合していないタンパク質又はポリペプチド、(2)他の細胞物質の存在に関して判断され得る純度について、自然界で見られない純度で存在する(例えば、同じ種に由来する他のタンパク質を含まない)タンパク質又はポリペプチド、(3)他の種の細胞によって発現されるタンパク質又はポリペプチド、又は(4)自然界で生じない(例えば、自然界で見られるポリペプチドの断片である、又は自然界で見られないアミノ酸類似体又は誘導体、又は標準的なペプチド結合以外の結合を含む)タンパク質又はポリペプチドである。したがって、化学合成されたポリペプチド、又はあるポリペプチドが自然状態で生じる細胞と異なる細胞系で合成されたそのポリペプチドは、そのポリペプチドの自然状態で結合する成分から「単離」される。単離により、当技術分野においてよく知られているタンパク質精製技術を用いてポリペプチド又はタンパク質は自然状態で結合する成分を実質的に含まないようにもされ得る。これまで定義されたように、「単離された」はそのように記載されているタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、又はオリゴペプチドが、それが合成される細胞から物理的に取り出されていることを必ずしも必要としない。
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド断片」という用語は全長型ポリペプチド、例えば、天然のタンパク質と比較して欠失、例えば、アミノ末端欠失及び/又はカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを指す。一実施形態ではそのポリペプチド断片はその断片のアミノ酸配列が天然の配列の対応する部分と同一である連続的配列である。断片は典型的には少なくとも5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、又は10アミノ酸の長さであり、又は少なくとも12アミノ酸、14アミノ酸、16アミノ酸、又は18アミノ酸の長さであり、又は少なくとも20アミノ酸の長さであり、又は少なくとも25アミノ酸、30アミノ酸、35アミノ酸、40アミノ酸、又は45アミノ酸の長さであり、又は少なくとも50アミノ酸又は60アミノ酸の長さであり、又は少なくとも70アミノ酸の長さである。
「融合タンパク質」という用語は異種性アミノ酸配列に結合しているポリペプチド又は断片を含むポリペプチドを指す。融合タンパク質は2種類以上の異なるタンパク質に由来し得る2つ以上の所望の機能性要素を含むように構築され得るので有用である。融合タンパク質は目的のポリペプチドの少なくとも10個の連続アミノ酸、又は少なくとも20個又は30個のアミノ酸、又は少なくとも40個、50個、又は60個のアミノ酸、又は少なくとも75個、100個、又は125個のアミノ酸を含む。その融合タンパク質に含まれる異種性ポリペプチドは通常は少なくとも6アミノ酸の長さであり、又は少なくとも8アミノ酸の長さであり、少なくとも15アミノ酸、20アミノ酸、又は25アミノ酸の長さである。IgG Fc領域などの大き目のポリペプチド及びさらには緑色蛍光タンパク質(「GFP」)クロモフォア含有タンパク質などのタンパク質全体を含む融合体は特に有用である。融合タンパク質は、ポリペプチド又はその断片をコードする核酸配列を異なるタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列とインフレームで構築し、次にその融合タンパク質を発現することにより組換え的に作製され得る。あるいは、融合タンパク質はポリペプチド又はその断片を別のタンパク質に架橋することにより化学的に作製され得る。
本明細書において使用される場合、あるタンパク質をコードする核酸配列が第2のタンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有している場合にそのタンパク質はその第2のタンパク質に対する「相同性」を有する、又はその第2のタンパク質と「相同」である。あるいは、あるタンパク質と第2のタンパク質が類似のアミノ酸配列を有している場合にそのタンパク質はその第2のタンパク質に対する相同性を有する。(したがって、「相同性タンパク質」という用語は2つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有していることを意味すると定義される。)本明細書において使用される場合、2つの領域のアミノ酸配列の間の(特に予想される構造的類似性に関しての)相同性は機能の類似性を意味するものと解釈される。
タンパク質又はペプチドに関して「相同性」が使用されるとき、同一ではない残基位置が多くの場合に保存的アミノ酸置換によって異なっていることが理解される。「保存的アミノ酸置換」はあるアミノ酸残基が類似の化学的性質(例えば、電荷又は疎水性)を有する側鎖(R基)を持つ別のアミノ酸残基により置換されているアミノ酸置換である。一般に、保存的アミノ酸置換はタンパク質の機能特性をあまり変化させない。2つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により相互に異なる場合、パーセント配列同一性又は相同性度はその置換の保存的性質のために上方に調節されて補正され得る。この調節を行うための手段は当業者によく知られている。例えば、Pearson、1994年、Methods Mol. Biol.誌、第24巻:307〜31頁、及び第25巻:365〜89頁を参照されたい。
次の6つのグループは相互に保存的代替物であるアミノ酸をそれぞれ含む:1)セリン、トレオニン;2)アスパラギン酸、グルタミン酸;3)アスパラギン、グルタミン;4)アルギニン、リシン;5)イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、及び6)フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン。
ポリペプチドの配列相同性もパーセント配列同一性と称され、通常は配列分析ソフトウェアを用いて測定される。例えば、ウィスコンシン州マジソン53705、910ユニバーシティー・アヴェニューにあるウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンターのジェネティクス・コンピューター・グループ(GCG)の配列分析ソフトウェアパッケージを参照されたい。タンパク質分析ソフトウェアは保存的アミノ酸置換をはじめとする様々な置換、欠失、及び他の修飾に割り当てられている相同性の尺度を使用して類似の配列をマッチさせる。例えば、GCGは、密接に関連するポリペプチド、例えば、異なる種の生物に由来する相同性ポリペプチドの間、又は野生型タンパク質とそのタンパク質の突然変異型タンパク質との間で配列相同性又は配列同一性を決定するために初期パラメーターと共に使用され得る「Gap」及び「Bestfit」などのプログラムを含む。例えば、GCG第6.1版を参照されたい。
様々な生物に由来する大多数の配列を含むデータベースに対して特定のポリペプチド配列を比較するときの例となるアルゴリズムはBLAST(Altschulら、J. Mol. Biol.誌、第215巻:403〜410頁(1990年);Gish及びStates、Nature Genet.誌、第3巻:266〜272頁(1993年);Maddenら、Meth. Enzymol.誌、第266巻:131〜141頁(1996年);Altshulら、Nucleic Acids Res.誌、第25巻:3389〜3402頁(1997年);Zhang及びMadden、Genome Res.誌、第7巻:649〜656頁(1997年))というコンピュータープログラムであり、特にblastp又はtblastn(Altshulら、Nucleic Acids Res.誌、第25巻:3389〜3402頁(1997年))である。
BLASTpの例となるパラメーターは、期待値:10(初期値)、フィルター:seg(初期値)、ギャップを開けるためのコスト:11(初期値)、ギャップを延長するためのコスト:1(初期値)、最大アラインメント:100(初期値)、ワードサイズ:11(初期値)、記載数:100(初期値)、ペナルティーマトリックス:BLOWSUM62である。相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは一般に少なくとも約16アミノ酸残基、又は少なくとも約20残基、又は少なくとも約24残基、又は少なくとも約28残基であり、又は約35残基を超える。多種多様な生物の配列を含むデータベースを検索するときはアミノ酸配列を比較することが有用であり得る。アミノ酸配列を用いるデータベース検索は当技術分野において知られているblastp以外のアルゴリズムにより判断され得る。例えば、GCG第6.1版中のプログラムであるFASTAを使用してポリペプチド配列を比較することができる。FASTAはクエリー配列とサーチ配列との間で最も良く重なる領域のアラインメントとパーセント配列同一性を提供する。Pearson、Methods Enzymol.誌、第183巻:63〜98頁(1990年)。例えば、アミノ酸配列の間のパーセント配列同一性は、参照により本明細書に援用されるGCG第6.1版において提供されたときのFASTAの初期パラメーター(2のワードサイズとPAM250スコアリングマトリックス)と共にFASTAを使用して決定され得る。
幾つかの実施形態では多量体性分子(例えば、ポリペプチド配列又は核酸配列)は、それらの配列が少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%同一である場合に相互に「相同」であると見なされる。幾つかの実施形態では多量体性分子は、それらの配列が少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%類似している場合に相互に「相同」であると見なされる。「相同」という用語は必ず少なくとも2つの配列(ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列)の間の比較を指す。幾つかの実施形態では2つのヌクレオチド配列がコードするポリペプチドが少なくとも約20アミノ酸からなる少なくとも1つの範囲について少なくとも約50%同一である、少なくとも約60%同一である、少なくとも約70%同一である、少なくとも約80%同一である、又は少なくとも約90%同一である場合にそれらのヌクレオチド配列は相同であると見なされる。幾つかの実施形態では相同ヌクレオチド配列は少なくとも4〜5個の一義的に特定されるひと続きのアミノ酸をコードする能力を特徴とする。相同であると見なされるヌクレオチド配列については相互に対するこれらのアミノ酸の同一性とおおよその間隔の両方が考慮されねばならない。60ヌクレオチド未満の長さのヌクレオチド配列の幾つかの実施形態では相同性は、少なくとも4〜5個の一義的に特定されるひと続きのアミノ酸をコードする能力によって判定される。幾つかの実施形態では2つのタンパク質配列が少なくとも約20アミノ酸からなる少なくとも1つの範囲について少なくとも約50%同一である、少なくとも約60%同一である、少なくとも約70%同一である、少なくとも約80%同一である、又は少なくとも約90%同一である場合にそれらのタンパク質は相同であると見なされる。
本明細書において使用される場合、「修飾型誘導体」は、一次構造配列においては基準ポリペプチド配列に対して実質的に相同であるが、例えば、インビボ又はインビトロでの化学的及び生化学的な修飾を含む、又はその基準ポリペプチド中に見出されないアミノ酸を組み込んでいるポリペプチド又はそれらの断片を指す。そのような修飾には、当業者によって容易に理解されるように、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば放射性核種による標識、及び様々な酵素的修飾が含まれる。ポリペプチドを標識するための様々な方法、及び様々な置換物、又はそのような目的に有用な標識は当技術分野においてよく知られており、1251、32P、35S、及び3Hなどの放射性同位体、標識された抗リガンド(例えば、抗体)に結合するリガンド、フルオロフォア、化学発光剤、酵素、及び標識されたリガンドに対する特定の結合対メンバーとして機能することができる抗リガンドを含む。標識の選択は必要とされる感度、プライマーとの結合のし易さ、安定性の要件、及び利用可能な機器に依存する。ポリペプチドを標識するための方法は当技術分野においてよく知られている。例えば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates(1992年、及び2002年に増補)を参照されたい。
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド突然変異体」又は「突然変異タンパク質」は、基準タンパク質又はポリペプチド、例えば、天然型タンパク質又は野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較して1つ以上のアミノ酸の挿入、重複、欠失、再構成又は置換を配列に含むポリペプチドを指す。突然変異タンパク質は1つ以上のアミノ酸点置換であって、ある位置の一つのアミノ酸が別のアミノ酸に変化しているアミノ酸点置換、基準タンパク質の配列の中での1つ以上の挿入及び/又は欠失であって、1つ以上のアミノ酸がそれぞれ挿入又は欠失されている挿入及び/又は欠失、及び/又はアミノ末端若しくはカルボキシ末端のどちらか、又は両方におけるアミノ酸配列の短縮を有し得る。突然変異タンパク質は基準タンパク質と比較して同じ生物活性、又は異なる生物活性を有し得る。
幾つかの実施形態では突然変異タンパク質は、例えば、その対照基準ポリペプチド又はタンパク質に対して少なくとも70%の全体的な配列相同性を有する。幾つかの実施形態では突然変異タンパク質は野生型タンパク質又はポリペプチドに対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、又は少なくとも90%の全体的な配列相同性を有する。他の実施形態では突然変異タンパク質は少なくとも95%配列同一性、又は98%、又は99%、又は99.5%又は99.9%の全体的な配列同一性を示す。
本明細書において使用される場合、「組換え型」は、(1)天然環境から取り出されている、(2)遺伝子が自然界で見出されるポリヌクレオチドの全て又は一部と関係していない、(3)自然界では結合していないポリヌクレオチドに機能的に結合している、又は(4)自然界で生じない生体分子、例えば、遺伝子又はタンパク質を指す。「組換え型」という用語はクローン化DNA単離物、化学合成されるポリヌクレオチド類似体、又は異種性システムによって生物学的に合成されるポリヌクレオチド、並びにそのような核酸によってコードされるタンパク質及び/又はmRNAに関して使用され得る。したがって、例えば、微生物によって合成されるタンパク質は、例えば、そのタンパク質がその細胞中に存在する組換え遺伝子から合成されたmRNAから合成される場合は組換え型である。ファージが組換え生体分子を含む場合はそのファージは「組み換え型」である。したがって、例えば、限定されないが、ファージのゲノムが組換え核酸配列を含む場合はそのファージは組み換え型である。
「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、「核酸」、又は「核酸配列」という用語は少なくとも10塩基長の多量体型のヌクレオチドを指す。その用語はDNA分子(例えば、cDNA又はゲノムDNA又は合成DNA)及びRNA分子(例えば、mRNA又は合成RNA)、並びに非天然型ヌクレオチド類似体、非天然型ヌクレオシド間結合、又はそれらの両方を含むDNA又はRNAの類似体を含む。核酸はあらゆる位相幾何学的構造をとることができる。例えば、核酸は一重鎖、二重鎖、三重鎖、四重鎖、部分二重鎖、分岐型、ヘアピン型、環状、又はパドロック構造であり得る。核酸(ポリヌクレオチドとも呼ばれる)はRNA、cDNA、ゲノムDNA、並びに前記の核酸の合成型及び混合型重合体のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含み得る。それらの核酸は、当業者によって容易に理解されるように、化学的又は生化学的に修飾されてもよく、又は非天然型ヌクレオチド塩基又は誘導体型ヌクレオチド塩基を含んでもよい。そのような修飾には、例えば、標識、メチル化、天然型ヌクレオチドのうちの1つ以上の類似体による置換;無電荷結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート等)、有電荷結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等)、ペンダント部分(例えば、ポリペプチド)、インターカレーター(例えば、アクリジン、ソラーレン等)、キレーター、アルキレーター、及び修飾型結合(例えば、αアノマー核酸等)などのヌクレオチド間修飾が含まれる。水素結合及び他の化学的相互作用を介して指定された配列に結合する能力についてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。そのような分子は当技術分野において知られており、例えば、分子骨格中のリン酸結合がペプチド結合によって置き換えられているものがそのような分子に含まれる。他の修飾には、例えば、リボース環が「ロックド」核酸中に見出される修飾のような架橋部分又は他の構造を含む類似体が含まれ得る。
「合成」RNA、DNA又は混合型重合体は細胞外で作製されたものであり、例えば、化学的に合成されたものである。
本明細書において使用される場合、「核酸断片」という用語は全長型基準ヌクレオチド配列と比較して欠失、例えば、5’末端欠失又は3’末端欠失を有する核酸配列を指す。一実施形態では核酸断片は、その断片のヌクレオチド配列が天然型配列の対応する位置について同一である連続的配列である。幾つかの実施形態では断片は少なくとも10ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、又は25ヌクレオチド長、又は少なくとも20ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、60ヌクレオチド長、70ヌクレオチド長、80ヌクレオチド長、90ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長、110ヌクレオチド長、120ヌクレオチド長、130ヌクレオチド長、140ヌクレオチド長、又は150ヌクレオチド長である。幾つかの実施形態ではある核酸配列の断片はオープン・リーディング・フレーム配列の断片である。幾つかの実施形態ではそのような断片はオープン・リーディング・フレームヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の(本明細書において定義される)ポリペプチド断片をコードする。
本明細書において使用される場合、ある生物(ファージを含む)のゲノム中の内在性核酸配列(又はその配列のコード化タンパク質産物)は、この内在性核酸配列の発現が変化するように異種性配列がその内在性核酸配列に隣接して配置されている場合に本明細書において「組換え型」と見なされる。この状況では異種性配列は、その異種性配列自体が内在性(同じ宿主細胞又はその子孫に由来する)であるか、又はその異種性配列が外来性(異なる宿主細胞又はその子孫に由来する)であるかどうかにかかわらず、自然界ではその内在性核酸配列に隣接していない配列である。例えば、宿主細胞のゲノム中の遺伝子の天然型プロモーターを(例えば相同組換えにより)あるプロモーター配列で置き換えることができ、そうしてこの遺伝子は変化した発現パターンを有する。この遺伝子はもう、自然界でその遺伝子に隣接する配列のうちの少なくとも幾つかより分離されているので、「組換え型」になる。
核酸は、自然界でゲノム中の対応する核酸に起こらないあらゆる修飾をその核酸が含む場合にも「組換え型」と見なされる。例えば、ある内在性コード配列が人為的に、例えば、ヒトによる介入によって導入された挿入、欠失又は点突然変異を含む場合にその内在性コード配列は「組み換え型」と見なされる。「組換え型核酸」は非相同部位において宿主細胞染色体に組み込まれている核酸、及びエピソームとして存在する核酸コンストラクトも含む。ファージに関して、「組換え型ファージゲノム」は人為的に、例えば、ヒトによる介入によって導入された挿入、欠失又は点突然変異を含むファージゲノムである。
本明細書において使用される場合、基準核酸配列の「縮合変異体」という言葉は、標準的な遺伝暗号に従って翻訳されてその基準核酸配列から翻訳されたアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を提供することができる核酸配列を包含する。「縮合オリゴヌクレオチド」又は「縮合プライマー」という用語は、必ずしも配列が同一ではないが、1つ以上の特定の区域内で相互に相同である標的核酸配列とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを意味するために使用される。
核酸配列の文脈における「パーセント配列同一性」又は「同一である」という用語は、2つの配列が最も一致するように整列させられると同一であるそれらの2つの配列の中の残基を指す。配列同一性比較の長さは少なくとも約9ヌクレオチド、一般的には少なくとも約20ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約24ヌクレオチド、典型的には少なくとも約28ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約32ヌクレオチド、及びさらにより典型的には少なくとも約36ヌクレオチド以上の長さにわたってよい。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる当技術分野において知られている多種多様なアルゴリズムが存在する。例えば、ウィスコンシン州マジソンのジェネティクス・コンピューター・グループ(GCG)のウィスコンシンパッケージ・第10.0版中のプログラムであるFASTA、Gap又はBestfitを使用してポリヌクレオチド配列を比較することができる。FASTAはクエリー配列とサーチ配列との間で最も良く重なる領域のアラインメントとパーセント配列同一性を提供する。Pearson、Methods Enzymol.誌、第183巻:63〜98頁(1990年)。例えば、核酸配列の間のパーセント配列同一性は、参照により本明細書に援用されるGCG第6.1版において提供されたときのFASTAの初期パラメーター(6のワードサイズとスコアリングマトリックス用のNOPAMファクター)と共にFASTAを使用して、又はGapの初期パラメーターと共にGapを使用して決定され得る。あるいは、配列はBLASTコンピュータープログラム(Altschulら、J. Mol. Biol.誌、第215巻:403〜410頁(1990年);Gish及びStates、Nature Genet.誌、第3巻:266〜272頁(1993年);Maddenら、Meth. Enzymol.誌、第266巻:131〜141頁(1996年);Altshulら、Nucleic Acids Res.誌、第25巻:3389〜3402頁(1997年);Zhang及びMadden、Genome Res.誌、第7巻:649〜656頁(1997年))、特にblastp又はtblastn(Altshulら、Nucleic Acids Res.誌、第25巻:3389〜3402頁(1997年))を使用して比較され得る。
核酸又はその断片に言及するとき、「実質的な相同性」又は「実質的な類似性」という用語は、適切なヌクレオチド挿入又は欠失を入れて別の核酸(又はその核酸の相補鎖)と最適になるように整列させると上で考察したようなFASTA、BLAST、又はGapなどのよく知られている配列同一性についてのどのアルゴリズムで測定されてもヌクレオチド塩基の少なくとも約50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%にヌクレオチド配列同一性が存在することを表している。
あるいは、核酸又はその断片がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で別の核酸に、別の核酸の鎖に、又は別の核酸の相補鎖にハイブリダイズするときに実質的な相同性又は実質的な類似性が存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験の背景での「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントな洗浄条件」は様々な物理的パラメーターに依存する。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に理解されるように塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基構成、相補的領域の長さ、及びハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数などの条件によって影響を受ける。当業者はどのようにこれらのパラメーターを変えてハイブリダイゼーションの特定のストリンジェンシーを達成するか知っている。
一般に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は特定の条件セットの下で特定のDNAハイブリッドの熱融点(Tm)より約25℃下で実施される。「ストリンジェントな洗浄」は特定の条件セットの下で特定のDNAハイブリッドのTmより約5℃低い温度で実施される。Tmは標的配列の50%が完全に合致するプローブにハイブリダイズする温度である。Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州(1989年)、9.51頁を参照されたい。本明細書における目的のためには「ストリンジェントな条件」は、液相ハイブリダイゼーションについて6×SSC(20×SSCが3.0MのNaClと0.3Mのクエンサンナトリウムを含む)、1%SDS中、65℃で8〜12時間にわたり、続いて0.2×SSC、0.1%SDS中、65℃で20分間にわたる水性(すなわち、ホルムアミドを含まない)ハイブリダイゼーションとして定義される。65℃でのハイブリダイゼーションはハイブリダイズする配列の長さとパーセント同一性をはじめとする多数の因子に応じて様々な速度で起こることが当業者によって理解される。
本明細書において使用される場合、「発現制御配列」は機能的に結合しているコード配列の発現に影響するポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は核酸配列の転写、転写後事象、及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列には適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列及びエンハンサー配列、スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルなどの効率的RNAプロセッシングシグナル、細胞質性mRNAを安定化する配列、翻訳効率を向上させる配列(例えば、リボソーム結合部位)、タンパク質安定性を向上させる配列、及び所望によりタンパク質分泌を向上させる配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なる。原核生物ではそのような制御配列は概してプロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、存在することが発現にとって必須であるあらゆる成分を最少でも包含するものとされ、また、存在することが有利である追加的成分、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列を包含し得る。
本明細書において使用される場合、「機能的に結合した」又は「機能可能的に結合した」発現制御配列は、目的の遺伝子を制御するためにその発現制御配列がその目的の遺伝子と連続的である結合、並びに目的の遺伝子を制御するためにトランスで、又は遠位で作用する発現制御配列を指す。
本明細書において使用される場合、「ベクター」はベクターが結合している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すものとする。1つの種類のベクターは「プラスミド」であり、プラスミドはその他のDNA区域をライゲートさせることができる環状二重鎖DNAループを一般的に指すが、プラスミドにはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅又は制限酵素による環状プラスミドの処理により生じたものなどの直鎖状二重鎖分子も含まれる。他のベクターにはコスミド、細菌人工染色体(BAC)、及び酵母人工染色体(YAC)が含まれる。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ウイルスベクターではその他のDNA区域をウイルスゲノムにライゲートすることができる(下でより詳細に考察する)。ある特定のベクターはそれらのベクターが導入されている宿主細胞で自律複製を行うことができる(例えば、宿主細胞で機能する複製起点を有するベクター)。他のベクターは宿主細胞に導入されるとその宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、その結果、宿主ゲノムと共に複製される。また、ある特定のベクターはそれらのベクターが機能的に結合している遺伝子の発現を行うことができる。そのようなベクターは本明細書において「組換え発現ベクター」(又は単に「発現ベクター」)と呼ばれる。
本明細書において使用される場合、「組換え型宿主細胞」(又は単に「組換え型細胞」又は「宿主細胞」)という用語は組換えベクターなどの組換え核酸が導入されている細胞を指すものとする。幾つかの例では「細胞」という言葉はある種の細胞を表す名前によって置き換えられる。例えば、「組換え型微生物」は微生物宿主細胞である組換え宿主細胞である。そのような用語は特定の対象細胞を指すばかりではなく、そのような細胞の子孫も指すことが理解されるべきである。突然変異か環境の影響のどちらかに起因して後続の世代においてある特定の改変が生じ得るのでそのような子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があり得るが、それでも本明細書において使用される「組換え型宿主細胞」、「組換え型細胞」、及び「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は培養されている単離細胞又は細胞株であり得、又は生体組織又は生物中に存在する細胞であり得る。
本明細書において使用される場合、「バクテリオファージ」は細菌に感染するウイルスを指す。同様に、「アーケオファージ」は古細菌に感染するウイルスを指す。「ファージ」という用語は両方のタイプのウイルスを指すために使用されるが、ある特定の例では文脈によって示されるようにバクテリオファージ又はアーケオファージを特異的に指すための簡略表記として使用される場合もあり得る。バクテリオファージとアーケオファージは宿主生合成機構の幾つか、又は全てを使用することにより細菌/古細菌内部で複製する細胞内絶対寄生生物(すなわち、細菌に感染するウイルス)である。様々なバクテリオファージ及びアーケオファージが様々な物質を含有し得るが、それらのファージは全て核酸とタンパク質を含有し、ある特定の状況下で脂質膜中に封入され得る。ファージに応じてその核酸はDNA又はRNAのどちらかであり得るが、両方であることはなく、様々な形態で存在し得る。
本明細書において使用される場合、「異種性核酸配列」は、通常は起こらない配置によってゲノム中の場所に配置されているあらゆる配列である。異種性核酸配列は自然界では特定の細菌/古細菌及び/又はファージ内に生じない配列を含む場合があり得、又は異種性核酸配列は、自然界で細菌/古細菌及び/又はファージ内に見出されるが、ゲノム中の正常では生じない位置に配置されている配列だけを含む場合があり得る。幾つかの実施形態ではその異種性核酸配列は天然ファージ配列ではなく、幾つかの実施形態ではその異種性核酸配列は異なるファージに由来するものではあるが、天然ファージ配列であり、さらに他の実施形態ではその異種性核酸配列は開始ファージのゲノム中で自然に生じる配列ではあるが、その後にその配列が自然界では生じない別の部位に移動し、その新しい部位においてその配列を異種性配列にする前記配列である。
「開始ファージ」又は「開始ファージゲノム」は自然環境又は人為的環境から単離された遺伝子工学で改変されていないファージ、又はそのようなファージのゲノムである。
「組換え型ファージ」又は「組換え型ファージゲノム」はファージへの異種性核酸配列の挿入により遺伝的に改変されているゲノムを含むそのファージ、又はそのファージのゲノムである。幾つかの実施形態では開始ファージのゲノムはゲノムの所定の位置に異種性核酸配列を導入する組換えDNA技術により改変される。幾つかの実施形態では異種性配列は、その配列の導入に対応して内在性ファージゲノムヌクレオチドを失わずに導入される。言い換えると、開始ファージゲノム中で塩基N1とN2が隣接している場合に異種性配列がN1とN2の間に挿入される。したがって、結果生じた組換えゲノムではその異種性配列の両側にヌクレオチドN1とN2がある。幾つかの事例では異種性配列が挿入され、内在性ヌクレオチドがその外来性配列によって取り除かれるか、又は置き換えられる。例えば、幾つかの実施形態では取り除かれる内在性配列の幾らか、又は全体の代わりに外来性配列が挿入される。幾つかの実施形態では外来性配列の挿入部位から遠位にあるファージゲノム中の位置から内在性配列が取り除かれる。
「ファージ宿主細胞」は子孫ファージ粒子を産生するためにファージが感染することができる細胞である。
「機能的に結合した」又は「機能可能的に結合した」発現制御配列は目的のコード配列の発現を制御するためにその目的のコード配列と発現制御配列が連続的である結合、並びにそのコード配列の発現を制御するためにトランス又は遠位で作用する発現制御配列のことを指す。
「コード配列」又は「オープン・リーディング・フレーム」はポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチドの配列である。そのコード配列の両末端は開始コドンと終止コドンである。
本明細書において使用される場合、「発現制御配列」という用語は機能的に結合しているコード配列の発現に影響するポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は核酸配列の転写、転写後事象、及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列には適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列及びエンハンサー配列、スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルなどの効率的RNAプロセッシングシグナル、細胞質性mRNAを安定化する配列、翻訳効率を向上させる配列(例えば、リボソーム結合部位)、タンパク質安定性を向上させる配列、及び所望によりタンパク質分泌を向上させる配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なる。原核生物ではそのような制御配列は概してプロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、存在することが発現にとって必須である全ての成分を最少でも内包するものとされ、また、存在することが有利である追加的成分、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列を内包し得る。
本明細書において使用される場合、「ファージゲノム」は天然のファージゲノム及びそれらの派生物を含む。概して(必ずというわけではないが)、それらの派生物は親として同じ宿主の中で増殖する能力を有する。幾つかの実施形態では天然ファージゲノムと派生ファージゲノムとの間の唯一の違いはそのゲノムが直鎖状である場合はそのファージゲノムの少なくとも一端からの、又はそのゲノムが環状である場合はそのゲノム中の少なくとも一点からのヌクレオチドの欠失とヌクレオチドの付加のうちの少なくとも一方である。
本明細書において使用される場合、「標的細菌」は検出可能な出力物を産生するファージが感染することができる細菌である。例えば、検出可能な出力物は細胞溶解を含む。したがって、ファージによる細菌細胞の溶解は、それらの細菌細胞はそのファージの「標的細菌」であることを示している。検出可能な出力物の別の例はファージによる細菌細胞の感染後のマーカーの発現である。適切なマーカーにはRNA及びポリペプチドが含まれる。
本明細書において使用される場合、「マーカー」には選択可能及び/又はスクリーニング可能マーカーが含まれる。本明細書において使用される場合、「選択可能マーカー」は、そのマーカーを発現しない類似の細胞の増殖を阻害又は促進する薬剤であって、存在するときはその増殖を阻害し、存在しないときはその増殖を促進する前記薬剤が存在しても、存在していなくても増殖する能力をそのマーカーを有する細胞に与えるマーカーである。そのような細胞はそれらの細胞の選択可能マーカーの発現のために「選択可能表現型」を有していると言うこともできる。例えば、アンピシリン抵抗性遺伝子(AmpR)はその遺伝子を有し、且つ、発現する細胞にアンピシリンが存在するときに増殖する能力を与える(Sutcliffe, J.G.、Proc Natl Acad Sci USA誌、1978年8月;第75巻(第8号):3737〜3741頁を参照のこと)。他の非限定的な例にはクロラムフェニコール、カナマイシン、及びテトラサイクリンに対する抵抗性を与える遺伝子が含まれる。他のマーカーにはURA3、TRP及びLEUが含まれ、それらはそれぞれ前記ウラシル、トリプトファン、及びロイシンが存在しないときの増殖を可能にする。
本明細書において使用される場合、「スクリーニング可能マーカー」は、そのマーカーを発現する細胞を特定する基礎として使用され得る検出可能な標識である。そのような細胞はそれらの細胞のスクリーニング可能マーカーの発現のために「スクリーニング可能表現型」を有していると言うこともできる(概して、選択可能マーカーの遺伝子産物が、そのマーカーを発現する細胞に選択可能性を付与するその遺伝子産物の機能と無関係にそのマーカーを発現する細胞を特定する基礎として使用され得るかぎりにおいて、選択可能マーカーはスクリーニング可能マーカーとして機能することもできる)。組換えファージによってコードされ、且つ、差次的に検出され得るあらゆる分子がスクリーニング可能マーカーとして機能し得る。スクリーニング可能マーカーは核酸分子又はその部分、例えば、一重鎖又は二重鎖であるRNA分子又はDNA分子であり得る。あるいは、スクリーニング可能マーカーはタンパク質又はその部分であり得る。適切なタンパク質マーカーには検出可能な反応産物の形成に対して触媒作用を及ぼす酵素が含まれる。一例はルシフェラーゼ又は変異体、例えばluxABなどの化学発光タンパク質、及びβ−ガラクトシダーゼである。別の例はホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素である。発光シグナルを生成するために使用されるタンパク質は2つの広範なカテゴリー、すなわち、直接的に光を発生するタンパク質(ルシフェラーゼ及び関連タンパク質)及び化学的カスケードの一部として間接的に光を発生するために使用されるタンパク質(ホースラディッシュペルオキシダーゼ)に分類される。生物学研究において使用されている最も一般的な生物発光タンパク質はイクオリンとルシフェラーゼである。前者のタンパク質はオワンクラゲ(Aequorea victoria)に由来し、溶液中のカルシウム濃度を決定するために使用され得る。ルシフェラーゼファミリーのタンパク質は広範囲の実験目的に適合させられている。ホタル及びウミシイタケ由来のルシフェラーゼは生物学研究において最も一般的に使用される。これらのタンパク質は2つの別個の機能ドメインに遺伝学的に分離されてもいて、それらのタンパク質が接近して共局在するときにのみ光を発生する。これらのタンパク質の両方の様々な発光スペクトルシフト型突然変異誘導体が過去10年にわたって作製されている。これらは生細胞内での多色画像撮影と共局在のために使用されている。化学発光シグナルを生成するために使用される他のグループのタンパク質はペルオキシダーゼとホスファターゼである。ペルオキシダーゼは光を発生する反応においてルミノールを酸化する過酸化物を生成する。これらのうちで最も広範に使用されているものはホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)であり、ホースラディッシュペルオキシダーゼはウエスタンブロットとELISAにおける検出のために広範に使用されている。同様に使用されている2つ目のグループのタンパク質はアルカリホスファターゼであり、アルカリホスファターゼは基質分子からリン酸を取り除き、その分子を不安定化し、光を発することになるカスケードを開始する。
他の適切なスクリーニング可能マーカーには蛍光タンパク質が含まれる。蛍光タンパク質には青色/UV蛍光タンパク質(例えば、TagBFP、Azurite、EBFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、及びT−Sapphire)、青緑色蛍光タンパク質(例えば、ECFP、Cerulean、SCFP3A、mTurquoise、単量体Midoriishi−Cyan、TagCFP、及びmTFP1)、緑色蛍光タンパク質(例えば、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、単量体Azami Green、TagGFP2、mUKG、及びmWasabi)、黄色蛍光タンパク質(例えば、EYFP、Citrine、Venus、SYFP2、及びTagYFP)、オレンジ色蛍光タンパク質(例えば、単量体Kusabira−Orange、mKOκ、mKO2、mOrange、及びmOrange2)、赤色蛍光タンパク質(例えば、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP−T、mApple、及びmRuby)、赤外蛍光タンパク質(例えば、mPlum、HcRed−Tandem、mKate2、mNeptune、及びNirFP)、近IR蛍光タンパク質(例えば、TagRFP657、IFP1.4、及びiRFP)、ロング・ストロークシフトタンパク質(例えば、mKeima Red、LSS−mKate1、及びLSS−mKate2)、光励起性蛍光タンパク質(例えば、PA−GFP、PAmCherry1、及びPATagRFP)、光変換性蛍光タンパク質(例えば、Kaede(green)、Kaede(red)、KikGR1(green)、KikGR1(red)、PS−CFP2、PS−CFP2、mEos2(green)、mEos2(red)、PSmOrange、及びPSmOrange)、及び光切換え性蛍光タンパク質(例えば、Dronpa)が含まれるが、これらに限定されない。記載された例に対する幾つかの変異体と代替物も当業者によく知られており、適切な用途において置き換えられ得る。
他の適切なマーカーにはエピトープが含まれる。例えば、抗体又は他の結合分子によって検出され得るエピトープを含むタンパク質はスクリーニング可能マーカーの例である。エピトープを認識する抗体はシグナル生成部分に(例えば化学発光タンパク質又は蛍光タンパク質の共有結合により)直接的に結合され得るし、又は例えばシグナル生成部分に直接的に結合されている二次抗体などの少なくとも1つのその他の結合試薬を使用して検出され得る。幾つかの実施形態ではエピトープがファージ又は標的微生物のタンパク質中に存在しないので試料中のそのエピトープの検出は、そのエピトープを含むタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えファージによる感染後にその微生物によってそのエピトープを含むタンパク質が産生されたことを示している。他の実施形態ではそのマーカーは自然界で標的微生物又はファージ中に存在するタンパク質の中の精製タグであり得る。例えば、そのタグ(例えば、6−Hisタグ)を使用して他の細菌タンパク質又はファージタンパク質からその異種性タンパク質を精製することができ、次に例えば抗体を使用してその精製タンパク質を検出することができる。
本明細書において使用される場合、「環境試料」は実験室細胞培養環境以外のあらゆる環境から得られた試料である。一般に、必ずというわけではないが、環境試料は、a)細菌細胞の最大限の増殖及び/又は代謝を支援しない温度、b)細菌細胞の最大限の増殖及び/又は代謝を支援しない栄養プロファイル、及びc)アッセイに使用されるファージの標的細菌ではない細菌細胞のうちの少なくとも1つを含む環境から取得される。幾つかの実施形態では環境試料中に存在する細菌の幾らか、又は全ては代謝的活性状態にない。限定されないが、環境試料は工業プラント、食品加工工場、獣医療供給源、食品、家畜、医療環境及び医療面、学校、福祉センター、クルーズ船、他の狭い宿舎、及び家から取得され得る。
A.組換えファージ
本開示はファージ宿主範囲を評価する新規方法を提供する。それらの方法は実施例に記載される一組のファージの標的細菌を明らかにするために使用された。その分析の結果としてファージLP40、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125、LP143、A511、及びP100が遺伝子操作用に選択された。それらの実施例はマーカーをコードする異種性核酸配列を含む組換え型のファージLP40、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125、LP143、A511、及びP100の作製について述べている。それらの実施例において示されているように、それらのファージは、本願を通してさらに開示されるように、例えば標的細菌を検出するのに有用である。
したがって、本開示はマーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージを提供する。幾つかの実施形態ではその組換えファージは、LP40、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125、LP143、A511、及びP100から選択される少なくとも1つのファージの少なくとも1kbのゲノム領域に対して実質的な相同性を備える少なくとも1kbの領域を含むゲノムを備える。幾つかの実施形態ではその相同性領域は少なくとも2kb、少なくとも3kb、少なくとも4kb、少なくとも5kb、少なくとも6kb、少なくとも7kb、少なくとも8kb、少なくとも9kb、少なくとも10kb、又はそれより多くを備える。幾つかの実施形態ではその相同性領域は前記組換えリステリアファージのゲノム全体である。幾つかの実施形態ではその実質的な相同性はその相同性領域にわたる少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%のヌクレオチド配列同一性である。
本開示はファージLP40のcps遺伝子のアミノ酸配列(配列番号6)、LP48のcps遺伝子のアミノ酸配列(配列番号8)、LP99のcps遺伝子のアミノ酸配列(配列番号10)、LP101のcps遺伝子のアミノ酸配列(配列番号12)、LP124のcps遺伝子のアミノ酸配列(配列番号14)、LP125のcps遺伝子のアミノ酸配列(配列番号16)、LP143のcps遺伝子のアミノ酸配列(配列番号18)、A511のcps遺伝子のアミノ酸配列(配列番号20)、及びP100のcps遺伝子のアミノ酸配列(配列番号22)を提供する。したがって、幾つかの実施形態では本開示は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージであって、配列番号6、8、10、12、14、16、18、20、及び22、並びにそれらの突然変異タンパク質から選択されるタンパク質をコードする核酸配列を備える前記組換えリステリアファージを提供する。
本開示はファージLP40のcps遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列(配列番号5)、LP48のcps遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列(配列番号7)、LP99のcps遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列(配列番号9)、LP101のcps遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列(配列番号11)、LP124のcps遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列(配列番号13)、LP125のcps遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列(配列番号15)、LP143のcps遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列(配列番号17)、A511のcps遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列(配列番号19)、及びP100のcps遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列(配列番号21)も提供する。したがって、幾つかの実施形態では本開示は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージであって、配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、及び21、並びにそれらの配列に対する実質的な相同性を備える核酸配列から選択される核酸配列を備える前記組換えリステリアファージを提供する。
幾つかの実施形態では前記マーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージはスクリーニング可能マーカーを備える。幾つかの実施形態では前記マーカーはルシフェラーゼである。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号2に対して少なくとも70%同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号1を備える核酸配列又は配列番号1に対する実質的な相同性を備える核酸配列によってコードされる。幾つかの実施形態ではその組換えリステリアファージはLP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、及びP100::fflucから選択される。幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージは、LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、及びP100::fflucから選択される少なくとも1つのファージに対して実質的な相同性を備えるゲノムを含むファージから選択される。
幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号4に対して少なくとも70%同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号3を備える核酸配列又は配列番号3に対する実質的な相同性を備える核酸配列によってコードされる。幾つかの実施形態ではその組換えリステリアファージはLP::040::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc、及びP100::nlucから選択される。幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージは、LP::040::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc、及びP100::nlucから選択される少なくとも1つのファージに対して実質的な相同性を備えるゲノムを含むファージから選択される。
幾つかの実施形態ではマーカーをコードする前記異種性核酸配列は、前記組換えファージゲノムにおいて少なくとも1つの調節性配列であって、そのファージゲノムにとってこれもまた異種性であるその調節性配列に機能的に結合している。幾つかの実施形態では標的細菌におけるマーカーをコードする前記異種性核酸配列の発現は、専らそのファージゲノムにとって異種性である調節性配列によって制御される。
幾つかの実施形態ではマーカーをコードする前記異種性核酸配列は前記組換えファージゲノムにおいてそのファージゲノムにとって内在性である少なくとも1つの調節性配列に機能的に結合している。言い換えると、マーカーをコードする前記異種性核酸配列は、マーカーをコードする前記異種性核酸配列が配置されている開始ファージゲノム中の位置のために内在性調節性配列に機能的に結合している。幾つかの実施形態では標的細菌におけるマーカーをコードする前記異種性核酸配列の発現は、専らそのファージゲノムにとって内在性である調節性配列によって制御される。幾つかの実施形態では標的細菌におけるマーカーをコードする前記異種性核酸配列の発現は、そのファージゲノムにとって内在性である調節性配列によって部分的に制御され、且つ、そのファージゲノムにとって異種性である調節性配列によって部分的に制御される。
幾つかの実施形態では前記マーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージはマーカーをコードする1つより多くの異種性核酸配列を備える。幾つかの実施形態ではその組換えファージはマーカーをコードする同じ核酸配列の複数のコピー(すなわち、同じマーカーをコードするコピー)を備える。幾つかの実施形態ではその組換えファージはマーカーをコードする1種類より多くの核酸配列のコピー(すなわち、異なるマーカーをコードする少なくとも2つのコピー)を備える。幾つかの実施形態ではそれらの1つより多くのコピーが組換えファージゲノム中の隣接する位置に配置される。他の実施形態ではそれらの1つより多くのコピーのうちの少なくとも1つ(最大で全て)が組換えファージゲノム中の隣接しない位置に配置される。
幾つかの実施形態では前記異種性核酸配列の長さは少なくとも100塩基、少なくとも200塩基、少なくとも300塩基、少なくとも400塩基、少なくとも500塩基、少なくとも600塩基、少なくとも700塩基、少なくとも800塩基、少なくとも900塩基、少なくとも1.0キロ塩基(kb)、少なくとも1.1kb、少なくとも1.2kb、少なくとも1.3kb、少なくとも1.4kb、少なくとも1.5kb、少なくとも1.6kb、少なくとも1.7kb、少なくとも1.8kb、少なくとも1.9kb、少なくとも2.0kb、少なくとも2.1kb、少なくとも2.2kb、少なくとも2.3kb、少なくとも2.4kb、少なくとも2.5kb、少なくとも2.6kb、少なくとも2.7kb、少なくとも2.8kb、少なくとも2.9kb、少なくとも3.0kb、少なくとも3.1kb、少なくとも3.2kb、少なくとも3.3kb、少なくとも3.4kb、少なくとも3.5kb、少なくとも3.6kb、少なくとも3.7kb、少なくとも3.8kb、少なくとも3.9kb、少なくとも4.0kb、少なくとも4.5kb、少なくとも5.0kb、少なくとも5.5kb、少なくとも5.5kb、少なくとも6.0kb、少なくとも6.5kb、少なくとも7.0kb、少なくとも7.5kb、少なくとも8.0kb、少なくとも8.5kb、少なくとも9.0kb、少なくとも9.5kb、少なくとも10kb、又はそれ以上である。幾つかの実施形態では前記異種性核酸配列の長さは500塩基以下、1.0kb以下、1.5kb以下、2.0kb以下、2.5kb以下、3.0kb以下、3.5kb以下、4.0kb以下、4.5kb以下、5.0kb以下、5.5kb以下、6.0kb以下、6.5kb以下、7.0kb以下、7.5kb以下、8.0kb以下、8.5kb以下、9.0kb以下、9.5kb以下、又は10.0kb以下である。幾つかのそのような実施形態では前記異種性核酸配列は、ファージゲノムよってコードされ、且つ、そのファージゲノムを含むファージ粒子によってパッケージされ得る最大の長さの異種性核酸配列よりも短い長さを備える。
幾つかの実施形態では前記異種性核酸配列の長さは100塩基から500塩基まで、200塩基から1,000塩基まで、500塩基から1,000塩基まで、500塩基から1,500塩基まで、1kbから2kbまで、1.5kbから2.5kbまで、2.0kbから3.0kbまで、2.5kbから3.5kbまで、3.0kbから4.0kbまで、3.5kbから4.5kbまで、4.0kbから5.0kbまで、4.5kbから5.5kbまで、5.0kbから6.0kbまで、5.5kbから6.5kbまで、6.0kbから7.0kbまで、6.5kbから7.5kbまで、7.0kbから8.0kbまで、7.5kbから8.5kbまで、8.0kbから9.0kbまで、8.5kbから9.5kbまで、又は9.0kbから10.0kbまでである。
幾つかの実施形態では前記組換えファージのゲノムの全長に対する前記異種性核酸配列の長さの比率は少なくとも0.05、少なくとも0.10、少なくとも0.15、少なくとも0.20、又は少なくとも0.25である。幾つかの実施形態では対応する開始ファージのゲノムの長さに対する前記組換えファージのゲノムの長さの比率は少なくとも1.05、少なくとも1.10、少なくとも1.15、少なくとも1.20、又は少なくとも1.25である。
幾つかの実施形態では前記異種性核酸配列は内在性開始ファージゲノム配列を失わずに開始ファージゲノムに挿入される。幾つかの実施形態では挿入された異種性核酸配列は内在性開始ファージゲノム配列と置き換わる。幾つかのそのような実施形態では前記異種性核酸配列は前記異種性核酸配列の長さよりも短い量の内在性ゲノム配列と置き換わる。したがって、そのような実施形態では組換えファージゲノムの長さは開始ファージゲノムの長さよりも長い。幾つかのそのような実施形態では前記異種性核酸配列は前記異種性核酸配列の長さよりも長い量の内在性ゲノム配列と置き換わる。したがって、そのような実施形態では組換えファージゲノムの長さは開始ファージゲノムの長さよりも短い。幾つかのそのような実施形態では前記異種性核酸配列は前記異種性核酸配列の長さと等しい量の内在性ゲノム配列と置き換わる。
幾つかの実施形態では異種性オープン・リーディング・フレームによってコードされるタンパク質又はポリペプチドは、ファージ宿主細胞内に存在するプロテアーゼによる切断を低減させるために改変される。例えば、計算アルゴリズムを使用して既知のプロテアーゼ切断部位を特定することができ、これらの部位を除去するために保存的置換を用いてそのオープン・リーディング・フレームの配列を改変することができる。あるいは、ファージ宿主細胞内又はファージ宿主細胞の培養物内に存在する少なくとも1種類のプロテアーゼに対する上昇した抵抗性を有する産物をコードするように部位特異的突然変異形成を用いてそのオープン・リーディング・フレーム配列を発展させる。
本開示は本開示の組換えファージから得られる単離核酸も提供する。幾つかの実施形態ではその単離核酸は本開示の組換えファージの単離ゲノムである。幾つかの実施形態ではその単離核酸は、本開示の組換えファージの全ゲノム未満の断片であってその組換えファージのゲノムの少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を備える前記断片を含む。幾つかの実施形態ではその単離核酸は、本開示の組換えファージの全ゲノム未満の断片であってそのファージゲノムの少なくとも20bp、少なくとも50bp、少なくとも100bp、少なくとも500bp、少なくとも1kb、少なくとも2kb、少なくとも3kb、少なくとも4kb、又は少なくとも5kbを備える前記断片を含む。幾つかの実施形態ではその単離核酸はこの段落において開示された断片に対して相同である断片を含む。
B.組換えファージ作製方法
当技術分野において知られているあらゆる方法を使用して開始ファージから遺伝的に改変されたファージを作製することができる。例えば、米国特許第5824468号明細書は遺伝的に改変されたファージの作製方法を開示している。ここに参照により本明細書に援用される2012年9月26日出願の同時係属出願番号第13/627060号明細書に代替的方法が開示されている。
実施例5は組換えファージを作製する新規の方法について記載している。時にはこの方法を本明細書においてファージ感染工学技術(PIE)と呼ぶ。この方法によりファージゲノムのあらゆる所望の位置に異種性核酸配列を挿入することが可能になる。PIE法はファージ宿主細胞に形質転換されるファージ・ターゲティングベクター(PTV)を活用する。PTVはファージゲノムに挿入される異種性核酸配列(マーカーをコードするオープン・リーディング・フレーム等)を備える。その異種性核酸配列の両側には所望の挿入部位に隣接する上流相同性領域と下流相同性領域がある。幾つかの実施形態では前記ベクター中のそれらの相同性領域は開始ファージゲノムでは直接的に隣接する。そのような実施形態により内在性ファージ配列を失わずにそのファージゲノムへその異種性核酸配列を挿入することが可能になる。幾つかの実施形態では前記ベクター中のそれらの相同性領域は、前記ベクターに含まれていない開始ファージゲノムのある領域の両側にある。そのような実施形態によりその挿入部位において開始ファージゲノムの領域を欠失してそのファージゲノムへその異種性核酸配列を挿入させることが可能になる。そのような実施形態により、例えば、置換配列による内在性ファージ配列の置換が可能になる。幾つかの実施形態では欠失される開始配列と置換配列は配列相同性、例えば、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれより高い相同性を示す。
前記上流相同性領域、下流相同性領域、及び異種性核酸配列がベクター内で組み合わされてPTVが作製される。適切なベクターの一例はpMK4である。しかしながら、当業者はこの目的のために使用することができる多数の適切なベクターを知っている。そのプラスミドは大腸菌などのあらゆる適切な宿主において単離され得る。確認された後にそのプラスミドはファージ宿主細胞に形質転換される。多数のリステリアファージに有用なそのような細胞の一例はリステリア・モノサイトゲネス株EGD−eである。
ファージ宿主へのPTVの形質転換が成功したところで形質転換ファージ宿主細胞を開始ファージと共培養することで最初の組換えを実施した。
組換えが起きたか評価するため、前記異種性核酸配列を備える組換えファージを特定するあらゆる適切な方法を使用して前記感染体をアッセイする。PCRは利用することができる1つの方法である。あるいは、前記異種性核酸配列がオープン・リーディング・フレームを含む場合、生じたファージが感染した細胞の培養物の中でそのオープン・リーディング・フレームによりコードされる転写物の存在、コードされる遺伝子産物の存在、又はコードされる遺伝子産物の機能性読み出し物をスクリーニングして組換えファージを特定することができる。
C.ファージ標的細菌
細菌の存在を検出するために本開示の組換えファージを使用することができる。標的細菌の検出は、その組換えファージが標的細菌に結合し、ファージゲノムをその標的細菌に移入する能力、及びマーカーをコードする前記異種性核酸配列のその細菌による発現に基づく。したがって、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えファージを使用して標的細菌を検出する方法の特異度は、そのファージへの曝露後にそのマーカーの発現を維持する細菌種の範囲に基づいている。時にはそのファージへの曝露後にそのマーカーの発現を維持する細菌種の範囲を本明細書においてそのファージの「宿主範囲」と呼ぶ。時には前記ファージの宿主範囲を構成する細菌種のセットを本明細書においてそのファージの「標的細菌」と呼ぶ。
本開示は、ファージ宿主範囲を評価し、したがって、ファージの標的細菌を明らかにする新規の方法を提供する。ある特定の実施形態では本方法は液体培養物中で候補細菌種をファージに曝露することを含む。その培養物中の細菌のそのファージによる感染と溶解を反映する培養物の透明化を引き起こすそのファージの能力は、その培養物中の細菌がそのファージの標的細菌であることの指標である。実施例において示されているように、この方法は驚くべきことにファージの真のファージ宿主範囲を評価する上で先行技術であるプレートベース・プラークアッセイよりも正確である。本明細書の幾つかの実施形態ではファージの「宿主範囲」又はファージの「標的細菌」は液体培養ベースのアッセイにおいてファージが透明化することができる細菌セットに基づいて定義される。
前記液体培養法は先行技術方法に対する改良であり、多数の目的にとって非常に有用である一方で、その方法は、標的細菌を検出するために組換えファージを使用する方法の全ての態様を実現することがない。そのような方法はその組換えファージが標的細菌に結合し、そのファージゲノムをその標的細菌に移入する能力、及びマーカーをコードする前記異種性核酸配列のその細菌による発現に依存する。したがって、たとえファージが特定の細菌細胞種の液体培養物を溶解することができないとしても、それでもそのファージがその細菌種に結合し、ファージゲノムをその標的細菌に移入し、そうしてマーカーをコードする異種性核酸配列のその細菌による発現を引き起こすことがあり得る。実際には、実施例によって示されるように、組換えファージへの曝露後にある種の細菌における前記マーカーの存在を検出するアッセイは、幾つかの実施形態では液体ベース宿主範囲アッセイなんかよりも感度が高い。したがって、本明細書の幾つかの実施形態ではファージの「宿主範囲」又はファージの「標的細菌」は、1)マーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えファージを提供すること、2)そのファージに試料を曝露すること、及び3)その曝露試料における前記マーカーの存在についてアッセイすることを含む過程により定義される。時にはこの種のアッセイを本明細書において概して「マーカー宿主範囲アッセイ」と呼ぶ。幾つかの実施形態では前記曝露試料における前記マーカーの存在についてのアッセイはmRNAの検出を含む方法による。幾つかの実施形態では前記曝露試料における前記マーカーの存在についてのアッセイはマーカータンパク質の直接的検出を含む方法、例えば、抗体を使用する方法による。幾つかの実施形態では前記曝露試料における前記マーカーの存在についてのアッセイはマーカータンパク質の機能的検出を含む方法による。例えば、そのマーカータンパク質がルシフェラーゼである場合にその曝露試料はルシフェリンに曝露してよく、光の発生をアッセイすることができる。この方法は本明細書において開示されるあらゆる種類のマーカーに適合することができ、当業者はマーカーのその検出方法の多数の変法が用いられ得ることを理解する。
ある特定の可変事項により、ある特定の条件下でファージの宿主範囲を改変することができる。一定の細菌増殖を維持し、したがって、最大のバクテリオファージ感染性を維持する条件は、細菌の検出方法が有用である環境ではめったに見出されない。貧栄養環境と微生物間の競争のために細菌は荒々しい変わりゆく状況に迅速に適応できることを強いられる。増殖と飢餓の連続的なサイクルからなる特定の生活様式は一般に祝宴(feast)と飢餓(famine)と呼ばれる。細菌は栄養が少ない苛酷な環境を生き延びるためにより抵抗力がある栄養細胞を産生することから複雑な発生プログラムまでの多種多様な機構を発展させている。ある特定の細菌種は、飢餓状態の延長の結果として「より良い時期」が来るまで、すなわち、好ましい増殖条件が回復され、それらの増殖条件によって好ましい感染条件が回復するまで、増殖と死の連続的なサイクルが起こる活動的な非増殖状態に入る。
バクテリオファージの感染性はバクテリオファージがコードするテールファイバー認識タンパク質の特異度ばかりではなく、存在する環境条件によっても部分的に決定される。その環境条件にはバクテリオファージが認識することができる細菌の代謝状態が含まれるが、これに限定されない。さらに、その環境条件にはそのファージが細菌に接触したときにそのバクテリオファージとその細菌が経験する環境の化学的組成と物理的組成が含まれる。限定されないが、pH、浸透圧、温度、流動学的性質及びその他などの溶液の環境的因子全てが細菌に感染するバクテリオファージの能力に影響を及ぼし得る。
これらの可変事項を考慮するため、液体透明化宿主範囲アッセイ及びマーカー宿主範囲アッセイにおいて細菌試料をファージに曝露するステップは限定的な条件下で実施され得る。それらの限定的な条件は、限られた持続時間、限られた温度、並びにa)炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも1種類の化合物、b)少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、c)少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、d)少なくとも脂質から選択される化合物、e)少なくとも1種類の無機化合物、及びf)少なくとも1種類の有機化合物の中の少なくとも1つが存在することのうちの少なくとも1つを含み得る。
幾つかの実施形態では前記炭水化物及び関連の化合物はグルコース、マンノース、及びマルトースなどの糖から選択される。幾つかの実施形態では前記炭水化物及び関連の化合物は、グルコースと比較して、必ずというわけではないが、消費されるとモル当たりより多くのモル数のNADPHを生成することができるペントースリン酸経路によって分解されるカルボキシ糖から選択される。幾つかの実施形態では前記炭水化物及び関連の化合物は、限定されないが、□□ケトグルタレート、D−リンゴ酸、又はピルビン酸などの中央代謝に絡む化合物から選択される。幾つかの実施形態では前記炭水化物及び関連の化合物は、必ずというわけではないが、環境中で潜在的に弱くなった状態又は損傷を受けた状態で存在する細胞に浸透圧の保護を与えることができるグリセロール及び他の炭水化物系浸透圧保護材(又は他の浸透圧保護材)から選択される。幾つかの実施形態ではグリセロールはファージ感染の効率を上げる体積排除材として機能する。幾つかの実施形態では前記炭水化物及び関連の化合物はアミノエタノールなどの糖アルコールから選択される。
幾つかの実施形態では前記窒素含有化合物はアンモニア、他のアミノ酸基礎的要素、及び遊離アミノ酸から選択される。前記遊離アミノ酸はゲノムにコードされるあらゆる標準的アミノ酸又はあらゆる非標準的アミノ酸であり得る。幾つかの実施形態では前記アミノ酸はグルタミン酸とグルタミンから選択される。幾つかの実施形態では前記アミノ酸は分岐鎖アミノ酸から選択される。幾つかの実施形態では前記窒素含有化合物はプロピオン酸などの分岐型アミノ酸の分解産物から選択される。
幾つかの実施形態では前記核酸及び関連の化合物はヌクレオチド、ヌクレオシド、デオキシヌクレオチド、及びデオキシヌクレオシドから選択される。幾つかの実施形態では前記核酸及び関連の化合物はイノシンなどのヌクレオチド生成経路の代謝物から選択される。
幾つかの実施形態では前記脂質化合物は脂肪酸及び関連の化合物から選択される。ツイーン20、40、及び80はエステル加水分解されると脂肪酸に変換され、それらを使用することもできる。幾つかの実施形態では前記脂質化合物はレシチン及び関連の化合物から選択される。
幾つかの実施形態では前記無機化合物は、例えば、チオサルフェートなどの塩から選択される。
幾つかの実施形態では前記有機化合物は脂肪族化合物、芳香族化合物、複素環化合物、及び非生物起源高分子から選択される。
幾つかの実施形態では前記の少なくとも1つの化合物が次のものから選択される。
化合物 CAS番号
1,2−プロパンジオール 57−55−6
2−アミノエタノール 141−43−5
グルクロン酸アミド 3789−97−7
チラミン 60−19−5
b−フェニルエチルアミン 156−28−5
L−アスパラギン酸 3792−50−5
L−プロリン 147−85−3
D−アラニン 338−69−2
D−セリン 312−84−5
L−グルタミン酸 6106−04−3
L−アスパラギン 70−47−3
D−アスパラギン酸 1783−96−6
L−グルタミン 56−85−9
Gly−Asp
D−トレオニン 632−20−2
Gly−Glu 7412−78−4
L−セリン 56−45−1
L−トレオニン 72−19−5
L−アラニン 56−41−7
Ala−Gly 687−69−4
Gly−Pro 704−15−4
L−アラビノース 87−72−9
N−アセチル−D−グルコサミン 7512−17−6
D−ガラクトース 59−23−4
D−トレハロース 99−20−7
D−マンノース 3458−28−4
ズルシトール 608−66−2
D−ソルビトール 50−70−4
グリセロール 56−81−5
L−フコース 2438−80−4
D,L−a−グリセロールリン酸 3325−00−6
D−キシロース 58−86−6
D−マンニトール 69−65−8
D−グルコース−6−リン酸 3671−99−6
D−リボース 50−69−1
L−ラムノース 3615−41−6
D−フルクトース 57−48−7
a−D−グルコース 50−99−7
マルトース 69−79−4
D−メリビオース 585−99−9
チミジン 50−89−5
a−メチル−D−ガラクトシド 3396−99−4
a−D−ラクトース 63−42−3
ラクツロース 4618−18−2
ショ糖 57−50−1
ウリジン 58−96−8
D−グルコース−1−リン酸 56401−20−8
D−フルクトース−6−リン酸 26177−86−637250−85−4
b−メチル−D−グルコシド 709−50−2
アドニトール 488−81−3
マルトトリオース 1109−28−0
2’−デオキシアデノシン 16373−93−6
アデノシン 58−61−7
m−イノシトール 87−89−8
D−セロビオース 528−50−7
イノシン 58−63−9
N−アセチル−D−マンノサミン 7772−94−3
D−プシコース 551−68−8
L−リキソース 1949−78−6
D−サッカリン酸 576−42−1
コハク酸 6106−21−4
D−グルクロン酸 14984−34−0
D−グルコン酸 527−07−1
D,L−乳酸 312−85−6
ギ酸 141−53−7
D−ガラクトン酸−g−ラクトン 2782−07−2
D,L−リンゴ酸 6915−15−7
酢酸 127−09−3
D−グルコサミン酸 3646−68−2
a−ケトグルタル酸 22202−68−2
a−ケト酪酸 2013−26−5
m−酒石酸 147−73−9
a−ヒドロキシグルタル酸−g−ラクトン 21461−84−7
a−ヒドロキシ酪酸 19054−57−0
クエン酸 6132−04−3
フマル酸 17013−01−3
ブロモコハク酸 923−06−8
プロピオン酸 137−40−6
ムチン酸 526−99−8
グリコール酸 79−14−1
グリオキシル酸 563−96−2
トリカルバリル酸 99−14−9
アセト酢酸 3483−11−2
モノ−メチルスクシネート 3878−55−5
D−リンゴ酸 636−61−3
L−リンゴ酸 138−09−0
p−ヒドロキシフェニル酢酸 156−38−7
m−ヒドロキシフェニル酢酸 621−37−4
ピルビン酸 113−24−6
L−ガラクトン酸−g−ラクトン 1668−08−2
D−ガラクツロン酸 91510−62−2
ピルビン酸メチル 600−22−6
ツイーン20 9005−64−5
ツイーン40 9005−66−7
ツイーン80 9005−65−6
宿主範囲アッセイにおいて検出される宿主範囲を改変する別のアプローチは細菌試料を前記ファージに曝露する前にその細菌を前処理することである。これにより、感染自体に用いられる条件から細菌細胞の状態(及び、おそらくはファージ感染に対するその細菌細胞の感受性)を改変するように指定されたステップを分けることが可能になる。例えば、前保温ステップの間に代謝速度を上昇させることができ、それによって次にファージによる細菌細胞の感染後の透明化又はマーカーの産生に影響する複製機能、転写機能、及び翻訳機能のうちの少なくとも1つを向上させることができる。さらに、そのような保温期間は表面受容体の発現又は細菌の細胞壁の組成も変化させることがあり得、それによってファージが増殖的にその細菌に感染することができるかどうかを変更することもできる。
したがって、幾つかの実施形態では細菌試料をファージ宿主範囲アッセイのために前記ファージに曝露する前に代謝促進条件で培養する。幾つかの実施形態ではそれらの細胞の代謝促進条件への曝露はそれらの細胞において細胞分裂を促進する。幾つかの実施形態ではそれらの細胞の代謝促進条件への曝露はそれらの細胞において細胞分裂を促進しない。幾つかの実施形態ではそれらの細胞の代謝促進条件への曝露はファージによる細菌細胞の感染後の透明化又はマーカーの産生に影響する複製機能、転写機能、及び翻訳機能のうちの少なくとも1つを促進する。
本明細書において使用される場合、「代謝促進条件」は、微生物が感染とファージ生活環の維持、及び/又はファージのゲノム中の異種性核酸配列によってコードされるマーカー遺伝子産物の発現後の感染を許容する微生物の代謝状態の発生を促進する条件である。幾つかの実施形態では代謝促進条件への曝露前のその微生物は感染とファージ生活環の維持を許容しない。他の実施形態では代謝促進条件への曝露前のその微生物は、対数期条件下で培養される相当する微生物と比較してその微生物の感染への感受性とファージ生活環の維持を低下させる代謝状態にある。そのような実施形態では代謝促進条件へのその微生物の曝露は、その微生物の感染への感受性とファージ生活環の維持を上昇させる。幾つかの実施形態では代謝促進条件は許容的な温度、pH、Po2、及び栄養の組合せのうちの少なくとも1つを含む。幾つかの実施形態では標的微生物は代謝促進条件下で少なくとも1回の細胞分裂を行う。幾つかの実施形態では標的微生物は代謝促進条件下で少なくとも1回の細胞分裂を行わない。
幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージと接触する前に代謝促進条件に曝露される。幾つかのそのような実施形態ではその試料はその後にファージと接触する前に代謝促進条件から取り除かれ、他の実施形態ではその試料はファージと接触するときに代謝促進条件下で維持される。幾つかの実施形態ではその試料は第1期間にわたって第1セットの代謝促進条件に曝露され、その後で第2セットの代謝促進条件に移される。幾つかの実施形態では前記試料が第2セットの代謝促進条件下で維持されている間に前記組換えファージが前記試料に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に5分から24時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に5分から6時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に10分から6時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に20分から6時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に30分から6時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に1時間から6時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に2時間から6時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に2時間から12時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に3時間から12時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に6時間から12時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に12時間から24時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料は少なくとも10分、少なくとも20分、少なくとも30分、少なくとも40分、少なくとも50分、少なくとも1時間、少なくとも1.5時間、又は少なくとも2時間にわたって代謝促進条件に曝露される。
この節に記載される条件の少なくとも1つの実施形態の下で宿主範囲分析を実施することにより、標的細菌の検出方法にとって有用なレベルの感度及び/又は選択性を提供する条件を明らかにすることができる。幾つかの実施形態ではその宿主範囲分析に使用される条件は、他の背景において標的細菌を検出するためにそれらのファージを使用するときの(すなわち、環境試料を検査するときの)そのファージを使用する標的細菌の検出方法にも使用される。
D.標的細菌の検出方法
本開示の組換えファージは標的微生物の検出に有用である。本開示は例となる組換えファージを提供し、且つ、その他の組換えファージの作製方法を提供する。本開示はある特定の開示された組換えファージの標的細菌も明らかにし、且つ、あらゆる組換えファージをはじめとするあらゆるファージの標的細菌を特定する方法も提供する。したがって、本開示により組換えファージを使用して標的微生物を検出する方法が可能になる。数ある中でも前記組換えファージの標的細菌の詳細な特徴解析を可能にすることにより、ある特定の実施形態では本開示は先行技術において利用可能ではなかった有用な方法を提供する。
前記方法は広範囲に適用可能であり、本開示の教示を考慮すると当業者はあらゆる種類の古細菌及び/又は細菌を検出するために前記方法をどのように適用するか理解する。幾つかの実施形態ではその古細菌はユリアーキオータである。幾つかの実施形態ではその古細菌はクレンアーキオータである。幾つかの実施形態ではその細菌は放線菌門、アクウィフェクス門、アルマティモナス門、バクテロイデス門、カルディセリクム門、クラミジア門、クロロフレクサス門、クリシオゲネス門、シアノバクテリア門、デフェリバクター門、ディノコックス・テルムス門、ディクチオグロムス門、エルシミクロビウム門、フィブロバクター門、フィルミクテス門、フゾバクテリウム門、ゲマティモナス門、ニトロスピラ門、プランクトミセス門、プロテオバクテリア門、スピロケータ門、シネルギステス門、テネリクテス門、サーモデスルフォバクテリア門、テルモトガ門から選択される系統のメンバーである。幾つかの実施形態ではその細菌はバシラス属、リステリア属、スタフィロコッカス属から選択される少なくとも1種類のフィルミクテス門である。幾つかの実施形態ではその細菌はアシドバシラス属(Acidobacillus)、アエロモナス属、バークホルデリア属、ナイセリア属、シュワネラ属、シトロバクター属、エンテロバクター属、エルウィニア属、エシェリキア属、クレブシエラ属、クライベラ属、モーガネラ属、サルモネラ属、シゲラ属、エルシニア属、コクシェラ属、リケッチア属、レジオネラ属、アビバクテリウム属(Avibacterium)、ヘモフィラス属、パスツレラ属、アシネトバクター属、モラクセラ属、シュードモナス属、ビブリオ属、キサントモナス属から選択される少なくとも1種類のプロテオバクテリア門である。幾つかの実施形態ではその細菌はマイコプラズマ属、スピロプラズマ属、及びウレアプラズマ属から選択される少なくとも1種類のテネリクテス門である。
本明細書において開示されるファージと方法を使用して検出される食物の一般的な汚染混入細菌には、限定されないが、サルモネラ属、大腸菌(限定されないが、病原性大腸菌、大腸菌O157:H7、志賀毒素生産性大腸菌、大腸菌O26、O大腸菌111、大腸菌O103、大腸菌O121、大腸菌O45及び大腸菌O145を含む)、大腸菌群(限定されないが、シトロバクター属、エンテロバクター属、ハフニア属、クレブシエラ属、セラチア属を含む)、シゲラ属、リステリア属、クロストリジウム属(ボツリヌス菌及びウェルシュ菌を含む)、ビブリオ属(ビブリオ・コレラ及びビブリオ・バルニフィカスを含む)、腸内細菌科、スタフィロコッカス属(黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌を含む)バシラス属(セレウス菌を含む)、カンピロバクター属(カンピロバクター・ジェジュニを含む)、シュードモナス属、ストレプトコッカス属、アシネトバクター属、クレブシエラ属、カンピロバクター属、及びエルシニア属が含まれる。
ある特定の実施形態では本方法は試料を提供すること、第1セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第1マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第1の種類のファージに前記試料を曝露すること、第2セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第2マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第2の種類のファージに前記試料を曝露すること、及びその曝露された試料の中の第1マーカーと第2マーカーの存在についてアッセイすることを含む。幾つかの実施形態では前記試料中の第1マーカーの検出はその試料中の標的細菌の第1セットの細菌の存在を表す。幾つかの実施形態では前記試料中の第2マーカーの検出はその試料中の標的細菌の第2セットの細菌の存在を表す。幾つかの実施形態では第1マーカーと第2マーカーは同じであり、前記試料中のそのマーカーの検出はその試料中の第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌のうちの少なくとも一方の細菌の存在を表す。
幾つかの実施形態では第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌は独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも2種を含む。幾つかの実施形態では第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌は独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも3種を含む。幾つかの実施形態では第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌は独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも4種を含む。幾つかの実施形態ではその一つの属の細菌はリステリアである。幾つかの実施形態では第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌は共通して少なくとも1種の細菌を含む。幾つかの実施形態では第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌は共通して少なくとも2種の細菌を含む。幾つかの実施形態では第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌は共通して少なくとも3種の細菌を含む。幾つかの実施形態では第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌は共通して少なくとも4種の細菌を含む。幾つかの実施形態ではそのリステリア属の種はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ(Listeria marthii)、リステリア・ロコウルティ(Listeria rocourti)及びリステリア・ウェルシメリから選択される。幾つかの実施形態ではそのリステリア属の種はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択される。
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュアの11、22、37、及び56から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュアの少なくとも4種類の対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態ではリステリア・イノキュアのそれらの少なくとも4種類の対立遺伝子型は11、22、37、及び56である。
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスのDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dから選択される少なくとも1種類のリボタイプを備える。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスの少なくとも19種類のリボタイプを備える。幾つかの実施形態ではリステリア・モノサイトゲネスのそれらの少なくとも19種類のリボタイプはDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dである。
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・ゼーリゲリの3、20、24、及び35から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・ゼーリゲリの少なくとも4種類の対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態ではリステリア・ゼーリゲリのそれらの少なくとも4種類の対立遺伝子型は3、20、24、及び35である。
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・ウェルシメリの15、27、32、及び89から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・ウェルシメリの少なくとも4種類の対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態ではリステリア・ウェルシメリのそれらの少なくとも4種類の対立遺伝子型は15、27、32、及び89である。
幾つかの実施形態では第1セットの標的細菌は同じ属の全てのメンバーである。幾つかの実施形態では第2セットの標的細菌は同じ属の全てのメンバーである。幾つかの実施形態では標的細菌の全てがリステリアである。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム(Enterococcus faceium)、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス(Kocuria varians)、クルチア・ギブソニイ(Kurthia gibsonii)、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス(Streptococcus galloyticus)、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス(Lactobacillus lactus)、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス(Micrococcus lutues)、シュードモナス・プロトジェンス(Pseudomonas protogens)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科のうちの少なくとも1つが含まれない。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム(Enterococcus faceium)、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス(Kocuria varians)、クルチア・ギブソニイ(Kurthia gibsonii)、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス(Streptococcus galloyticus)、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス(Lactobacillus lactus)、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス(Micrococcus lutues)、シュードモナス・プロトジェンス(Pseudomonas protogens)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科が含まれない。
幾つかの実施形態では本方法は、第3セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第3マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第3の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第4セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第4マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第4の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第5セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第5マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第5の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第6セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第6マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第6の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第7セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第7マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第7の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第8セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第8マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第8の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第9セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第9マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第9の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、10以上のセットの標的細菌に感染することができ、且つ、10以上のマーカーをコードする異種性核酸配列を備える10以上の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。3種類以上のファージを利用する幾つかの実施形態ではそれらの3種類以上のマーカーの全てが異なる。3種類以上のファージを利用する幾つかの実施形態ではそれらの3種類以上のマーカーの全てが同じである。3種類以上のファージを利用する幾つかの実施形態ではそれらのマーカーのうちの2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、又は9種類が同じである。
幾つかの実施形態では本方法において使用される少なくとも1種類のファージがA511、P100、LP40、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125、及びLP143、及びそれらの派生株から選択される。幾つかの実施形態では本方法において使用される全ての種類のファージがA511、P100、LP40、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125、及びLP143、及びそれらの派生株から選択される。
幾つかの実施形態では第1マーカーはスクリーニング可能なマーカーである。幾つかの実施形態では第1マーカーはルシフェラーゼである。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号2に対して少なくとも70%同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号4に対して少なくとも70%同一である。
幾つかの実施形態では第1の種類のファージはLP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、及びP100::ffluc、及びそれらのファージの派生株から選択される。幾つかの実施形態では第1の種類のファージはLP40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc、及びP100::nlucから選択される。
幾つかの実施形態では第2マーカーはスクリーニング可能なマーカーである。幾つかの実施形態では第2マーカーはルシフェラーゼである。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号2に対して少なくとも70%同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号4に対して少なくとも70%同一である。
幾つかの実施形態では第2の種類のファージはLP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、及びP100::fflucから選択される。幾つかの実施形態では第2の種類のファージはLP40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc、及びP100::nlucから選択される。
幾つかの実施形態では本方法は第1の種類のファージと第2の種類のファージに対して前記試料を同時に曝露することを含む。
幾つかの実施形態では前記試料は環境試料である。
幾つかの実施形態では第1マーカーが前記試料中に検出され、その試料中の標的細菌の第1セットの細菌の存在を表す。幾つかの実施形態では第2マーカーが前記試料中に検出され、その試料中の標的細菌の第2セットの細菌の存在を表す。幾つかの実施形態では第1マーカーと第2マーカーは同じであり、そのマーカーが前記試料中に検出され、その試料中の第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌のうちの少なくとも一方の細菌の存在を表す。
幾つかの実施形態では環境試料に対するそのアッセイの偽陽性率は5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下である。幾つかの実施形態では環境試料に対するそのアッセイの偽陰性率は5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下である。
幾つかの実施形態では前記試料は前記ファージに曝露される前に代謝促進条件に曝露される。
幾つかの実施形態では本方法は、標的細菌に感染することができる前記ファージに前記試料を曝露する前の一時期に前記試料を代謝促進条件下でインキュベートすることをさらに含む。
ある特定の実施形態では本方法は試料を提供すること、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも1種類の組換えリステリアファージであって、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される前記組換えリステリアファージに前記試料を曝露すること、及びその曝露された試料の中の前記マーカーの存在についてアッセイすることを含む。幾つかの実施形態では本方法は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも1種類の組換えリステリアファージであって、組換えA511と組換えP100から選択される前記組換えリステリアファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では前記試料中の前記マーカーの検出はその試料の中のリステリアの存在を表す。
幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ(Listeria marthii)、リステリア・ロコウルティ(Listeria rocourti)、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも1つの種を含む。幾つかの実施形態では前記試料中の前記マーカーの検出は、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ(Listeria marthii)、リステリア・ロコウルティ(Listeria rocourti)、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも1つの種のその試料における存在を表す。
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも1つの種を含む。幾つかの実施形態では前記試料中の前記マーカーの検出は、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも1つの種のその試料における存在を表す。
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュアの11、22、37、及び56から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備え、前記試料中の前記マーカーの検出はリステリア・イノキュアの11、22、37、及び56から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型の存在を表す。幾つかの実施形態では前記少なくとも1種類のリステリアファージはリステリア・イノキュアsigB対立遺伝子型11、22、37、及び56に感染することができる。
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスのDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dから選択される少なくとも1種類のリボタイプを備え、前記試料中の前記マーカーの検出はリステリア・モノサイトゲネスのDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dから選択される少なくとも1種類のリボタイプの存在を表す。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスのリボタイプDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dを含む。
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ゼーリゲリの3、20、24、及び35から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備え、前記試料中の前記マーカーの検出はリステリア・ゼーリゲリの3、20、24、及び35から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型の存在を表す。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ゼーリゲリsigB対立遺伝子型3、20、24、及び35を含む。
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ウェルシメリの15、27、32、及び89から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備え、前記試料中の前記マーカーの検出はリステリア・ウェルシメリの15、27、32、及び89から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型の存在を表す。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ウェルシメリsigB対立遺伝子型15、27、32及び89を含む。
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも2つの種を含む。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも3つの種を含む。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ(Listeria marthii)、リステリア・ロコウルティ(Listeria rocourti)、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも4つの種を含む。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム(Enterococcus faceium)、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス(Kocuria varians)、クルチア・ギブソニイ(Kurthia gibsonii)、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス(Streptococcus galloyticus)、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス(Lactobacillus lactus)、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス(Micrococcus lutues)、シュードモナス・プロトジェンス(Pseudomonas protogens)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科のうちの少なくとも1つが含まれない。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム(Enterococcus faceium)、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス(Kocuria varians)、クルチア・ギブソニイ(Kurthia gibsonii)、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス(Streptococcus galloyticus)、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス(Lactobacillus lactus)、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス(Micrococcus lutues)、シュードモナス・プロトジェンス(Pseudomonas protogens)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科が含まれない。
幾つかの実施形態では前記マーカーはスクリーニング可能なマーカーである。幾つかの実施形態では前記マーカーはルシフェラーゼである。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号2に対して少なくとも70%同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号4に対して少なくとも70%同一である。幾つかの実施形態では前記ファージはLP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、及びP100::fflucから選択される。幾つかの実施形態では前記ファージはLP::40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc、及びP100::nlucから選択される。
幾つかの実施形態では前記試料は環境試料である。
幾つかの実施形態では前記マーカーが前記試料中に検出され、前記試料中の標的細菌の第1セットの細菌の存在を表す。
幾つかの実施形態では環境試料に対するそのアッセイの偽陽性率は5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下である。幾つかの実施形態では環境試料に対するそのアッセイの偽陰性率は5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下である。幾つかの実施形態では前記試料は前記ファージに曝露される前に代謝促進条件に曝露される。
幾つかの実施形態では前記試料は曝露試料中のマーカーの存在についてのアッセイが実施される前に一定の時間にわたってファージに曝露される。幾つかの実施形態ではその時間は1分から24時間まで、5分から12時間まで、5分から6時間まで、5分から3時間まで、5分から2時間まで、5分から1時間まで、5分から50分まで、5分から40分まで、5分から30分まで、5分から20分まで、又は5分から10分までである。幾つかの実施形態ではその時間は1時間から2時間まで、1時間から4時間まで、又は2時間から4時間までである。幾つかの実施形態ではその時間は少なくとも1分間、少なくとも5分間、少なくとも10分間、少なくとも20分間、少なくとも30分間、少なくとも40分間、少なくとも50分間、又は少なくとも1時間である。
幾つかの実施形態では曝露試料中のマーカーの存在についてのアッセイが実施される前に曝露試料中のあらゆるファージ及び/又はファージの部分が実質的に除去される。
本開示の方法の幾つかの実施形態では前記方法は陽性対照及び陰性対照のうちの少なくとも一方に対して検査試料中のマーカーの検出レベルを比較することをさらに含む。陽性の結果及び/又は陰性の結果を定義することを目的としてそのアッセイを校正するために陽性対照及び/又は陰性対照を使用することができる。
E.組成物
ある特定の実施形態では本明細書において提供されるファージ宿主範囲のアッセイ方法により、先行技術によって提供されない感度限界でのファージの宿主範囲の特徴解析が可能になり、したがって、ファージの標的細菌の限定が可能になる。それらの方法、及びそれらの方法によって特徴解析されるファージの1つの使用法は、標的細菌を検出する系において一緒に使用することができるファージの有用な組合せを特定することである。幾つかの実施形態ではそのような系はファージを個別に提供し、その後でアッセイ前、又はアッセイ中にそれらのファージが混合される。あるいは、そのような系はファージの有用な混合物、例えば、アッセイにおいて使用される緩衝液の中に提供されるファージを備える。幾つかの実施形態ではファージの有用な組合せを備える組成物はまた、必ずそのアッセイ中に作製される。したがって、本開示はファージを含む組成物も提供する。
幾つかの実施形態では前記組成物は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも1種類の組換えリステリアファージであって、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される前記組換えリステリアファージ、及びa)炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも1種類の化合物、b)少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、c)少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、d)少なくとも脂質から選択される化合物、e)少なくとも1種類の無機化合物、及びf)少なくとも1種類の有機化合物のうちの少なくとも1つから選択される少なくとも1種類の非ファージ性成分を含む。幾つかの実施形態ではその組成物は1,2−プロパンジオール、2−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、b−フェニルエチルアミン、L−アスパラギン酸、L−プロリン、D−アラニン、D−セリン、L−グルタミン酸、L−アスパラギン、D−アスパラギン酸、L−グルタミン、Gly−Asp、D−トレオニン、Gly−Glu、L−セリン、L−トレオニン、L−アラニン、Ala−Gly、Gly−Pro、L−アラビノース、N−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトース、D−トレハロース、D−マンノース、ズルシトール、D−ソルビトール、グリセロール、L−フコース、D,L−a−グリセロール、ホスフェート、D−キシロース、D−マンニトール、D−グルコース−6−リン酸、D−リボース、L−ラムノース、D−フルクトース、a−D−グルコース、マルトース、D−メリビオース、チミジン、a−メチル−D−ガラクトシド、a−D−ラクトース、ラクツロセム(lactulosem) ショ糖、ウリジン、D−グルコース−1−リン酸、D−フルクトース−6−リン酸、b−メチル−D−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、2’−デオキシアデノシン、アデノシン、m−イノシトール、D−セロビオース、イノシン、N−アセチル−D−マンノサミン、D−プシコース、L−リキソース、D−サッカリン酸、コハク酸、D−グルクロン酸、D−グルコン酸、D,L−乳酸、ギ酸、D−ガラクトン酸−g−ラクトン、D,L−リンゴ酸、酢酸、D−グルコサミン酸、a−ケトグルタル酸、a−ケト酪酸、m−酒石酸、a−ヒドロキシグルタル酸−g−ラクトン、a−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、D−リンゴ酸、L−リンゴ酸、p−ヒドロキシフェニル酢酸、m−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、L−ガラクトン酸−g−ラクトン、D−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン20、ツイーン40、ツイーン80のうちの少なくとも1つを含む。
幾つかの実施形態では前記組成物は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも2種類の組換えリステリアファージであって、組換えA511及びその派生株、組換えP100及びその派生株、組換えLP40及びその派生株、組換えLP44及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される前記組換えリステリアファージを含む。幾つかの実施形態では前記組成物は、a)炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも1種類の化合物、b)少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、c)少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、d)少なくとも脂質から選択される化合物、e)少なくとも1種類の無機化合物、及びf)少なくとも1種類の有機化合物のうちの少なくとも1つから選択される少なくとも1種類の非ファージ性成分をさらに含む。幾つかの実施形態ではその組成物は1,2−プロパンジオール、2−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、b−フェニルエチルアミン、L−アスパラギン酸、L−プロリン、D−アラニン、D−セリン、L−グルタミン酸、L−アスパラギン、D−アスパラギン酸、L−グルタミン、Gly−Asp、D−トレオニン、Gly−Glu、L−セリン、L−トレオニン、L−アラニン、Ala−Gly、Gly−Pro、L−アラビノース、N−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトース、D−トレハロース、D−マンノース、ズルシトール、D−ソルビトール、グリセロール、L−フコース、D,L−a−グリセロール、ホスフェート、D−キシロース、D−マンニトール、D−グルコース−6−リン酸、D−リボース、L−ラムノース、D−フルクトース、a−D−グルコース、マルトース、D−メリビオース、チミジン、a−メチル−D−ガラクトシド、a−D−ラクトース、ラクツロセム(lactulosem) ショ糖、ウリジン、D−グルコース−1−リン酸、D−フルクトース−6−リン酸、b−メチル−D−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、2’−デオキシアデノシン、アデノシン、m−イノシトール、D−セロビオース、イノシン、N−アセチル−D−マンノサミン、D−プシコース、L−リキソース、D−サッカリン酸、コハク酸、D−グルクロン酸、D−グルコン酸、D,L−乳酸、ギ酸、D−ガラクトン酸−g−ラクトン、D,L−リンゴ酸、酢酸、D−グルコサミン酸、a−ケトグルタル酸、a−ケト酪酸、m−酒石酸、a−ヒドロキシグルタル酸−g−ラクトン、a−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、D−リンゴ酸、L−リンゴ酸、p−ヒドロキシフェニル酢酸、m−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、L−ガラクトン酸−g−ラクトン、D−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン20、ツイーン40、ツイーン80のうちの少なくとも1つを含む。
幾つかの実施形態では前記系又は組成物は組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される少なくとも2種類の組換えリステリアファージを含む。幾つかの実施形態では前記系又は組成物は組換えLP040及びその派生株、組換えLP048及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される少なくとも3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、又はそれより多くの組換えリステリアファージを含む。
F.製品
幾つかの実施形態ではマーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも1種類の組換えリステリアファージを含む前記系又は組成物は製品の形で提供される。そのような製品は、例えば、標的細菌を検出するアッセイを実施するために一緒に使用することができる他の成分と組み合わさった、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも1種類のnantリステリアファージを提供する手段として有用である。幾つかの実施形態では前記製品は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える前記の少なくとも1種類の組換えリステリアファージを含む少なくとも1つの容器を備える。
幾つかの実施形態では前記製品は、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される少なくとも2種類の組換えリステリアファージを含む少なくとも1つの容器を備える。幾つかの実施形態では前記系又は組成物は組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される少なくとも3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、又はそれより多くの組換えリステリアファージを含む。前記製品が1種類より多くのファージを含む幾つかの実施形態では、それらのファージの全てが別々の容器に提供される。他の実施形態ではそれらのファージのうちの2種類以上が一つの容器の中で組み合わされて提供される。
幾つかの実施形態では前記製品は、a)炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも1種類の化合物、b)少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、c)少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、d)少なくとも脂質から選択される化合物、e)少なくとも1種類の無機化合物、及びf)少なくとも1種類の有機化合物のうちの少なくとも1つから選択される少なくとも1種類の非ファージ性成分を含む溶液をさらに備える。幾つかの実施形態では前記製品は、1,2−プロパンジオール、2−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、b−フェニルエチルアミン、L−アスパラギン酸、L−プロリン、D−アラニン、D−セリン、L−グルタミン酸、L−アスパラギン、D−アスパラギン酸、L−グルタミン、Gly−Asp、D−トレオニン、Gly−Glu、L−セリン、L−トレオニン、L−アラニン、Ala−Gly、Gly−Pro、L−アラビノース、N−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトース、D−トレハロース、D−マンノース、ズルシトール、D−ソルビトール、グリセロール、L−フコース、D,L−a−グリセロール、ホスフェート、D−キシロース、D−マンニトール、D−グルコース−6−リン酸、D−リボース、L−ラムノース、D−フルクトース、a−D−グルコース、マルトース、D−メリビオース、チミジン、a−メチル−D−ガラクトシド、a−D−ラクトース、ラクツロセム(lactulosem) ショ糖、ウリジン、D−グルコース−1−リン酸、D−フルクトース−6−リン酸、b−メチル−D−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、2’−デオキシアデノシン、アデノシン、m−イノシトール、D−セロビオース、イノシン、N−アセチル−D−マンノサミン、D−プシコース、L−リキソース、D−サッカリン酸、コハク酸、D−グルクロン酸、D−グルコン酸、D,L−乳酸、ギ酸、D−ガラクトン酸−g−ラクトン、D,L−リンゴ酸、酢酸、D−グルコサミン酸、a−ケトグルタル酸、a−ケト酪酸、m−酒石酸、a−ヒドロキシグルタル酸−g−ラクトン、a−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、D−リンゴ酸、L−リンゴ酸、p−ヒドロキシフェニル酢酸、m−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、L−ガラクトン酸−g−ラクトン、D−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン20、ツイーン40、ツイーン80のうちの少なくとも1つを含む溶液を備える容器を含む。幾つかの実施形態では前記製品中に存在する少なくとも1種類の組換えリステリアファージは少なくとも1種類の非ファージ性成分を含む溶液の中に存在する。他の実施形態ではそのファージと溶液は別々に提供されており、例えば、使用者によって混合され得る。
次の実施例は本明細書において開示される本発明のある特定の実施形態の利用方法をさらに充分に説明するように働く。これらの実施例は例示目的で提供されており、本発明本明細書において開示される本発明の真の範囲を限定するように働くべきではない。
実施例1:リステリアパネル
多種多様な組合せのリステリア種と亜種を含む細菌株パネルがリステリアファージの特徴解析のために選択された。そのパネルは食品加工工場及び食品小売り店舗をはじめとする様々な地理的ニッチェ及び環境的ニッチェから単離された株を含む。その細菌株パネル内の多様性を最大にするために充分に地理的に離れた食品加工環境から細菌株を得ることに特に考慮を払った。
最初に構築されたパネルは272種類のリステリア単離株を含み、4つの主要な種のリステリア(リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・イノキュア、リステリア・ウェルシメリ及びリステリア・ゼーリゲリ)を代表している(表1)。そのパネルは、一般的にそのデータの亜種に対する意味のある外挿を可能にする充分な包括深度を確実にするために各種の中に様々な亜種の代表的な単離株を含む。その細菌パネル用の株の選択は食品環境内の、及びヒト疾患と関係する特定の株の出現率に基づいた。食品小売店の環境スクリーニングは最も一般的に特定されるリステリア亜種を特定するために対立遺伝子型解析を用い、その環境スクリーニングによって、ある特定の対立遺伝子型が多くの場合に特定された種の集団の中で非常に代表的であることが明らかにされた(Williams, S.K.ら、J Food Prot誌、第74巻、63〜77頁(2011年);Sauders, B.D.ら、Appl Environ Microbiol誌、第78巻、4420〜4433頁(2012年))。食品及びヒト疾患に由来する単離株を代表する最も一般的なリボタイプのそれぞれにつき10種類のリステリア・モノサイトゲネス株をコレクション用に選択した。これらの集団は大いに重複しており、出現率について強力な相関を有しており、したがって、食品加工工場において特定するのに最も有用な株である。ヒト疾患及び食品加工工場において単離されたリボタイプに基づくリステリア・モノサイトゲネス株の包括範囲を見ると、構築されたパネルはそれぞれ約86%と91%の包括度を表す。各リステリア・モノサイトゲネスリボタイプから10株を選択する目的は、グループ内の多様性の確認を可能にしてリステリア・モノサイトゲネス種の合理的に完全な包括を確実にすることであった。
リステリア・モノサイトゲネスを越えて拡大し、且つ、その属の中の他の種を包括するため、追加的な種と亜種の多様性を考慮して前記パネル用の追加の株を選択した。食品加工工場において一般的に特定される種と亜種に再度焦点を置いた。リステリア・ウェルシメリ、リステリア・イノキュア及びリステリア・ゼーリゲリの最も一般的な対立遺伝子型のそれぞれを代表する10種類の単離株を選択した。構築されたパネルはSaundersらによって特定されたリステリア・イノキュアの96%、リステリア・ゼーリゲリの98%、及びリステリア・ウェルシメリリボタイプの100%を含み、リステリア属を正確に表す。したがって、構築されたリステリア宿主パネルは、リステリア属に対するあらゆるバクテリオファージの宿主範囲分析用のツールとして機能する。したがって、このパネルを使用してあらゆる所与のファージの標的細菌を明らかにすることができる。
そのパネルのメンバーの属、種、及び亜種が表1に提供されている。










実施例2:プレートベースのファージ宿主範囲アッセイ
所与のバクテリオファージの宿主範囲を定量化するため、通常はバクテリオファージ産生に使用される株であるそのバクテリオファージ用の基準株に対してそのバクテリオファージの所与の単離株に対するプラーク形成効率を標準化した。プラーク形成効率を決定するためにはそのファージの希釈シリーズを作製し、各宿主に対して力価測定する。本明細書において報告される研究の前にはこれはファージ宿主範囲分析の標準的方法であった。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州(2001年)を参照されたい。
前記リステリア細菌株パネルを使用して特定のバクテリオファージの宿主範囲を決定した。これを行うため、検査される各リステリア株の培養を5mlのLBL1の中で始め、撹拌振盪機において30℃で一晩培養し、そして16時間増殖させた。各細菌宿主株について30μlの16時間培養物を270μlの新しいLBL1培地と混合した。各細胞希釈物に4mlのLBL1軟質寒天を加えて100mmのペトリディッシュ中のLBL1寒天に上層した。その軟質寒天上層を室温で冷やして固化させた。さらに、宿主範囲単離株と同様に基準株(A511とP100用のFSL F6−367)を処理した。LBL1培地中の前記バクテリオファージの10倍希釈シリーズを10-1から10-8まで調製した。前記バクテリオファージの各希釈物の5μlを軟質寒天上層にスポットし、その液体を吸収させ、その後でそのプレートを30℃で16時間保温した。保温後に各希釈シリーズに存在するプラークを計数し、前記基準株に対して比較して各宿主範囲単離株についてのプラーク形成効率を提供した。その宿主範囲は、その基準株に対して比較した、実験宿主で観察された力価のパーセンテージとして表された。基準株の10%を超えるプラーク形成効率を示す細菌株(表2、濃い灰色の影)は宿主範囲内にあると見なした。基準株の10%未満であるが、0.01%を超えるプラーク形成効率を示す細菌株(表2、明るい灰色の影)はそのファージに対する感受性が弱いと見なした。基準株の0.01%未満のプラーク形成効率を示す細菌株(表2、影無し)はファージの宿主範囲外と見なした。検査された細菌株の多くについて見られた現象は文献中及び当技術分野において「過剰細胞殺滅」(ECK)と説明されているものであった(表2、黒色)。例えば、Shawら(J Immunol Methods誌、1983年;第56巻(第1号):75〜83頁)を参照されたい。高いファージ濃度で菌叢を完全に透明化するが、しかしながらその後の希釈で透明化されなかったときにある株が特定のファージについてECKを示すと定義した。
前記プレートベースの宿主範囲決定により、リステリア単離株ライブラリーに対するA511及びP100の宿主範囲を大まかに見積もることが可能になる。細菌株ライブラリー中の検査した272株のうち67株と120株がそれぞれA511とP100によるプラーク形成を維持した(表2)。この方法の最大の制約は、所与のバクテリオファージについてライブラリー全体を処理するために必要な時間の長さ、及びECK現象のために全宿主範囲を決定することができないことであった。バクテリオファージA511及びP100について、検査した宿主範囲パネルの中の272種類の細菌株のうちそれぞれ117株と42株がECKを示し、したがって、これらの株の宿主範囲について何の情報ももたらさなかった。さらに、ECK現象を考慮すると、及びプレート上で増殖する細菌と液体培養物中で増殖する細菌との間の一般的な差異のため、宿主範囲を決定するための前記プレートベースの方法は液体ベースの利用法についての宿主範囲を表さない場合があり得ると仮定した。
実施例3:液体培養ファージ宿主範囲アッセイ
プレートベース宿主範囲法においてA511とP100の両方によって示された過剰細胞殺滅(ECK)現象の出現率により、そのプレートベースがどちらかのファージの宿主範囲を決定するのに有用であり得たほど有用ではないことが示される。それらの欠陥を克服するために新規の液体ベース宿主範囲アッセイを開発した。その液体ベース宿主範囲アッセイは、バクテリオファージを含む、又は含まない培養物の光学密度を比較することにより特定の細菌単離株に感染するファージの能力が決定されるエンドポイントアッセイである。
ブレインハートインフュージョン(BHI)寒天プレート上でリステリア宿主パネル株コレクション(表1)の培養を始め、2mlの96ディープウェルディッシュ中の1mlのBHI液の中に単一性コロニーを接種し、滅菌通気性滅菌膜で覆い、30℃で16時間培養した。それらの96ウェルプレートの16時間培養物の各々を300μlの平底光学96ウェルプレート中の198μlのLBL1中に1:10,000の割合で希釈し、その後で1×105pfuの前記バクテリオファージ又は等量のLBL1のどちらかを前記96ウェルプレートの各ウェルに添加した。バクテリオファージと細菌細胞の希釈物のこの濃度は、各ウェルにおいて1の感染多重度(MOI)に近づくものであった。前記ファージ又は対照の添加後にそれらのプレートを50rpmで振盪しながら26℃で16時間保温した。プレートを96ウェルプレートリーダー(Biotek Eon Microplate Reader)中に設置し、撹拌振盪することによりプレートを3秒間撹拌して培養から沈降した細胞を再懸濁した。その撹拌の後に各ウェルの光学密度を600nm(OD600)波長光において測定した。バクテリオファージが存在するときのその細菌単離株のOD600の非感染細菌単離株培養物に対する比率を尺度として使用して細菌株の感染効率を決定した。0.4以下の比率を有する細菌株(表2、濃い灰色の影)はそのバクテリオファージによる感染に対する感度が高いと見なした。
前記液体ベース宿主範囲アッセイにより細菌株パネル中の272株のうちのA511とP100に対して感受性を有する192細菌株と153細菌株が特定された(表2)。このデータは、A511がその宿主範囲パネルのおよそ70%に感染することができ、P100がおよそ58%に感染することができることを示している。前記液体ベースの宿主範囲と対照的に、A511とP100についてそれぞれあるプラーク形成効率を示す62細菌株と120細菌株が前記プレートベース宿主範囲法により特定された。前記プレートベース宿主範囲法で特定された株のうち、わずかに8株のA511感受性細菌株と3株のP100感受性細菌株が液体ベースの透明化アッセイにおいて透明化を示さなかった。その液体ベースアッセイはエンドポイントアッセイであり、バクテリオファージ感染と細菌細胞増殖との間の反応速度論的相互作用を表しているので上昇した細胞増殖速度を有するある特定の細菌株はその株が感染に対して感受性を有するとしても培養物を飽和させることが可能であり得、このことにより、プラークベースのアッセイにおいて特定される少数の株が液体アッセイにおいて特定されなかった理由を説明することができる。
前記プレートベース宿主範囲アッセイにおいてECK表現型を示す株についてのデータを収集する能力のため、前記液体ベース宿主範囲アッセイにより特定されるその他の株が存在した。この表現型を示す多数の株がA511とP100の宿主範囲に関する大量の未知の情報をもたらした。前記液体ベースアッセイは前記プレートベース宿主範囲法の最大の欠点のうちの1つであるECK現象を排除してしまった。2つの要因がECKの欠如に寄与した。第一に、前記液体ベースアッセイにおいて使用されるファージの濃度は前記プレートベース宿主範囲アッセイにおいてECKを示したファージの濃度よりも低い設定濃度である。第二に液体感染体内のバクテリオファージの非局在性濃度と低いMOIにより細菌細胞とバクテリオファージとの間の相互作用数が減少する。その限定的相互作用により非生産性遭遇の可能性が低下し、重複感染、すなわち、細胞の複数のバクテリオファージによる感染が減少する。ECKを排除することによりあるバクテリオファージに対する特定の細菌細胞の感受性を測定するための感度が実質的に上昇し、その感度によりリステリア属の種の中のあるバクテリオファージの宿主範囲をより正確に表した。
前記液体ベース宿主範囲アッセイはバクテリオファージの宿主範囲を決定するためのプレートベースの系を使用する先行方法に対して実質的な進歩を示した。プレートベースの方法以外のフォーマットでこれらのバクテリオファージを培養する能力について報告する先行文献は無かった。バクテリオファージの宿主範囲を決定するスピードが前記液体ベース宿主範囲アッセイを実行することができるスピードのために前記パネルが構築されたときの7〜10日から数時間の作業時間までに増加することからも前記液体フォーマットは有用である。さらに、宿主感受性を採点するハイスループット性によって、以前にはあり得なかった複数のバクテリオファージ宿主範囲の同時決定が可能になった。複数のバクテリオファージを同時処理する能力により、細菌培養生理と培地ロットの間の変動を最小限にして複数のバクテリオファージをより直接的に比較することが可能になった。まとめると、増加したスピードと直接的なバクテリオファージ特徴解析により本明細書に記載される複数のファージの迅速な処理とバクテリオファージ遺伝子操作の優先順位付けが可能になった。また、前記液体ベース宿主範囲アッセイにより、プレートベース宿主範囲アッセイと比較して、予測される製品における潜在的なバクテリオファージの機能決定をより正確に表すことが可能になった。増加したスピード、より直接的な比較を行う能力、及び最終製品についてより直接的な方法でバクテリオファージの機能性を評価する能力の組合せのため、ほとんどの状況において前記プレートベース宿主範囲法よりも前記液体ベース宿主範囲アッセイが著しく有用なものになる。
P100とA511のバクテリオファージからなるカクテルの効力を特定の株に感染する前記バクテリオファージのそれぞれの能力により決定することができる。P100とA511からなるカクテルによる宿主パネルの感染は個別の宿主範囲の外挿から予期される追加の宿主範囲を示している。感染中におけるルシフェラーゼの最適生産に必要とされるバクテリオファージ濃度に関する観察に基づき、感染に単一性のバクテリオファージが使用されるにしても、多重ファージカクテルが使用されるにしても、添加されるバクテリオファージの濃度を1×107という一定の総ファージ濃度に維持した。A511とP100からなるそのカクテルは構築されたパネルの74%の包括度を示し、一方で個々のバクテリオファージはそれぞれ70%と55%の包括度を示す(表2)。そのパネルのこの包括度の上昇は、それらのファージが大いに重複する包括範囲を有する一方でP100感染に感受性を有する組の株がA511の株に完全には含まれないという面から生じている。個々の液体ベースの宿主範囲からバクテリオファージカクテルの機能を外挿する能力は、より完全なカクテルを構築するために遺伝子操作される新しいバクテリオファージを特定及び優先順位付けするための強力なツールを提供する。
環境試料から集められた試料に対するP100とA511からなるバクテリオファージカクテルの機能を構築された宿主パネルから厳密に推測することはできない。環境検査における試料採取部位は細菌の多種多様な集団を表しており、多くの場合に個々の場所に存在するリステリア属の1つより多くの種又は亜種を有する。地理及び起源について多様な食品加工工場における環境試料採取により、第三者検査室において培養ベースの検出方法を用いてリステリアについて陽性と確認された31試料が特定された。これらの31種類の陽性試料のうち10試料が複数のリステリア種又は亜種を含んでいた。A511とP100のカクテルはそれらの31種類の陽性試料のうちの24種類(77%)を検出することができた。前記液体ベースの宿主範囲の結果と採取されたそれらの環境試料との間の相関より、より完全にリステリア属を包括するためにバクテリオファージカクテルをさらに繰返し作製することが可能になり、且つ、前記液体ベース宿主範囲法の有用性が検証された。
実施例4:その他のリステリアファージの宿主範囲の特徴解析
リステリア宿主株パネルの構築と迅速な液体ベース宿主範囲アッセイの開発により追加のバクテリオファージの迅速なスクリーニングが可能になり、リステリア属の包括範囲を増加させることになるバクテリオファージが特定された。前記液体ベース宿主範囲アッセイにおいて25種類の追加のバクテリオファージが前記宿主パネルに対してスクリーニングされ、非感染対照と比較した透明化に基づいて宿主感受性について分析された。そのデータが表3に提示されている。株が0.4以下の比率を示している(濃い灰色の影)場合、それらの株は宿主範囲内であると見なした。その培養物のOD600の決定時に培養培地又は培養プレートの吸光度について補正せず、したがって、0.09という比率は感染により完全に透明化した培養物を構成した。様々なリステリア株によって得られた最大OD600値の変化のため、所与のバクテリオファージに対して感受性を有するリステリア株を示すために0.4という保守的な比率を選択した。0.4を超えるOD600比率を有する株は宿主範囲外にあると見なした(表3、影無し)。有用な宿主パネル包括度を提供し、ファージ・ターゲティングベクターの開発に適したゲノム配列利用可能性を有し、且つ、形質転換を最も受けやすいリステリアの株であるリステリア・モノサイトゲネスEGD−e株に感染することが可能であるという基準に基づき、アッセイされたこれらの25種類のバクテリオファージから7種類のバクテリオファージを遺伝子操作に進むために選択した。
A511及びP100に加えて選択された7種類のバクテリオファージはLP44、LP40、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125、及びLP143であった。前記リステリア宿主株パネルの78%超を包括するアッセイされた個々のファージは無い。まとめると、それらのバクテリオファージは液体ベース宿主範囲アッセイでアッセイされると前記宿主株パネルのおよそ92%を包括する(表3)。この組合せアプローチにより、環境試料コレクション中のリステリアの存在についての信頼できる判定を提供するための必要なリステリア種の包括度を提供するバクテリオファージカクテルの構築が可能になる。
2つの異なる遺伝的積載物であるホタルルシフェラーゼとナノルシフェラーゼで前記ファージのゲノムを操作した後にこれらのファージの宿主範囲を再検査してそれらのゲノム改変がそれらのファージの適応性に影響していないこと、又は標的細菌に感染するそれらのファージの能力を損ねていないことを確かめた。感染におけるバクテリオファージの混合の結果を検討するため、前記液体ベース宿主範囲アッセイを用いてファージ感染の組合せ効果を検査した。これらの感染のため、前記カクテル内のそれぞれ等量のファージからなる1×105pfu(すなわち、二成分ファージカクテルがそれぞれについて5×104pfuの2つの構成ファージからなる)という一定の濃度でファージの終濃度が維持された。
実施例5:リステリアファージの操作
組換えファージを作製するために新しいファージ遺伝子操作方法を開発した。時にはこの方法を本明細書においてファージ感染工学技術(PIE)と呼ぶ。この方法によりファージゲノムのあらゆる所望の位置に異種性核酸配列を挿入することが可能になる。挿入用に選択された最初の部位はLoessnerら(Appl. Environ Microbiol.誌、第62巻:1133〜1140頁)において使用された部位であり、主要キャプシドタンパク質遺伝子cpsの下流であった。ホタルルシフェラーゼのコード配列(配列番号1)又はNanoLucルシフェラーゼのコード配列(配列番号3)をこの場所に挿入した。
PIE法は所望の挿入部位の直ぐ上流及び下流の約1KBのファージ配列(上流相同性領域(UHR)及び下流相同性領域(DHR)と呼ぶ)が両側にあるルシフェラーゼ遺伝子配列を含むファージ・ターゲティングベクターPTVを使用する。これらの挿入物のそれぞれは、組み立てを容易にするために20bpの相同性を加えつつ所望のアンプリコンを増幅するPCRプライマーを使用して作製された。GeneArtシームレス・アッセンブリー・キット(ライフテクノロジーズ社)を使用してプラスミドを構築した。それらの3種類の挿入物(UHR、luc、DHR)をSmaIとPstI(NEB)で制限消化されたグラム陽性/グラム陰性シャトルベクターpMK4中に組み込んだ。
A511ファージゲノム配列はGenbankで入手可能である(NC_009811)。A511ファージはATCCから入手することができる(PTA−4608(商標))。
PIE法を用いてA511のcps遺伝子の終止コドンの直後、ゲノム配列の塩基46,695と塩基46,696の間にホタルルシフェラーゼ遺伝子(配列番号1)を挿入した。そのファージゲノムから欠失された配列は無かった。リボソーム結合部位を含む16bp配列(GAGGAGGTAAATATAT)をホタルルシフェラーゼ遺伝子の始まり(ATG)の前に配置した。
ファージA511を遺伝子操作するため、「pMAK upf」オリゴと「pMAK upr」オリゴを使用してcps遺伝子の1276塩基を増幅し、「A511 UHR」断片を形成した。「pMAK lucf」プライマーと「pMAK lucr」プライマーを使用してルシフェラーゼ遺伝子を増幅し、「A511 luc」断片を作製した。「pMAK lucf」プライマーはまた、ルシフェラーゼ遺伝子の上流にリボソーム結合部位(シャイン・ダルガノ)を付け加えた。「pMAK dnf」と「pMAK dnr」を使用してcps終止コドン直後の1140bpを増幅し、「A511 DHR」と名付けた。
製造業者の指示に従ってGeneArtシームレス・アッセンブリー・キットを使用してSmaI/PstIで制限消化されたpMK4にこれらの3つのアンプリコンを組み込んだ。一度、大腸菌中に単離されたところでそのプラスミドの配列を解析して正確な増幅と構築を検証した。検証されたところでそのプラスミドをリステリア・モノサイトゲネス株EGD−eに形質転換し、BHI−クロラムフェニコール(10μg/ml)寒天プレート上で選択した。
PTVのEGD−eへの形質転換に成功したところで最初の組換えを実施する。一晩培養したA511::FF PTV含有EGD−eの培養物を1:100に希釈し、0.1のOD600まで増殖させた。その後にこの培養物を希釈して0.02のOD600まで戻し、2mlの体積中に1e5pfu/mlの野生型A511ファージと混合した。この感染体を50rpmで撹拌して30℃で一晩培養した。
組換えが生じたか評価するために次の日に前記感染体をアッセイした。まず、残っているあらゆる細胞を殺滅し、且つ、PTVにより作製されるバックグラウンド・ルシフェラーゼを破壊するために溶菌液とクロロホルムを混合した。前記ファージはクロロホルム耐性であり、それはバクテリオファージに共通の形質である。4(体積/体積)%のCHCl3を溶菌液に添加し、ボルテックス混合し、遠心し、そして上清を回収した。一晩培養したEGD−eの培養物の1:10希釈物を組換え溶菌液に添加して(90μlの細胞希釈物、10μlのファージ溶解液)試験感染を行った。細胞を使用せずに対照感染を設定した。それらの感染体を30℃で3時間静置培養し、その後にGlomax 20/20上で発光についてアッセイした。20μlの感染体を100μlのPromegaルシフェラーゼ・アッセイ試薬(NanoLucファージについては20μlの溶菌液と20μlのNanoGlo)と混合し、その後に10秒の積分時間(NanoGloについては1秒)を用いて読み込んだ。組換え溶菌液は光を発生し、その溶菌液の中に組換えファージが存在することを示した。
前記組換えファージを濃縮及び単離するため、前記組換え溶菌液中に存在する野生型ファージからその組換えファージを分離する必要があった。連続的な希釈と分割を用いた。入力ファージの10倍希釈物を用いて溶菌液を作製し、ルシフェラーゼ活性についてそれらの溶菌液をアッセイすることにより組換えファージの存在についてスクリーニングを行った。
組換え効率は1:1e5〜1:1e6であると推定された。純粋な組換え溶菌液を単離するため、(Appl. Environ Microbiol.誌、第62巻:1133〜1140頁)に記載される方法を次のように改変した。初期組換え溶菌液の力価を測定した。それぞれ1e6、1e5、及び1e4pfu/mlのその組換え溶菌液を用いて20本の1mlの溶菌液を用意した。すなわち、OD0.02の1mlのEGD−eに1eXのファージを加えて50rpm、30℃で一晩培養した。翌日、上記のように各溶菌液についてCHCl3処理を行った。それらの溶菌液を使用して上記のように感染体を用意した。Glomax 20/20上で各溶菌液をアッセイした(FFについて20μlの感染体と100μlの試薬、nlucについて20μlの感染体と20μlのNanoGlo)。その目的は、感染すると発光を示す最少の数のファージで作製される溶菌液を確認することであった。この溶菌液が特定されたところでその溶菌液の力価を測定し、1e3、1e2及び1e1pfu/mlを有する溶菌液を用意した。1e2個のファージで作製された発光性溶菌液が単離されたところで単一性プラークを得るためにこの溶菌液を蒔いた。プラークを選んでSM緩衝液中に入れた。これらの「浸漬物」をdH2O中に1:10で希釈し、ルシフェラーゼ遺伝子とファージ配列との間の組換え接合部の存在を調べるために「DBONO360」と「DBON0361」を使用するPCRによりアッセイした。
P100ファージゲノム配列はGenbankで入手可能である(DQ004855)。P100はATCCから入手することができる(PTA−4383(商標))。
P100のルシフェラーゼ挿入部位も同じcps遺伝子の下流であった。P100におけるホタルルシフェラーゼ挿入の部位はP100ゲノム配列の塩基13,196と塩基13,197の間である。
次のことを例外としてA511と同様にしてP100を遺伝子操作した。「pMAK dnf」プライマーと「pMAK dnr P100」プライマーを使用して「P100 DHR」断片を増幅した。プラークを選んで100μlのSM緩衝液に入れることにより一個の組換えプラークを特定した。この浸漬物の10μlを50μlのルシフェリンと混合し、前記ルミノメーター上で発光を確認した。陽性物を特定するこの方法を後の組換えファージ単離において活用した。
ホタルルシフェラーゼ遺伝子とA511::fflucについて記載された方法を使用して次のファージ、すなわち、LP48、LP124、LP125、LP99、LP101、LP143を遺伝子操作した。
NanoLuc遺伝子を使用して次のファージ、すなわち、A511、P100、LP40、LP124及びLP125を遺伝子操作した。
次のPCR断片を増幅することによりA511::nluc用のPTVを構築した。A511溶菌液を鋳型として使用して、pMAK upfオリゴとDBON0356オリゴを使用してUHR断片を生成し、DBON0359オリゴとpMAK dnrオリゴを使用してDHR断片を増幅した。PromegaプラスミドpNL1.1を鋳型として使用してDBON0357オリゴとDBON0358オリゴを使用してNanoLuc断片を増幅した。構築法とその後のPIE法は記載した構築法及びPIE法と同様であった。
pMAK dnrオリゴよりもむしろpMAK dnr P100オリゴを使用してDHR断片を増幅することを例外として、P100::nluc用のPTVと遺伝子操作をA511::nlucと同様に実施した。
次の変更によりLP124、LP125、及びLP40用のPTVをA511::nlucと同様に構築した。プラスミドのより効率的な構築を可能にするため、DBON0359オリゴとDBON0382オリゴを使用して増幅されるDHR断片はより短いものであった。また、2つの追加の終止コドン(TAATAA)をこれらのファージのcps遺伝子の直ぐ下流に付加することにより挿入部位を改変した。追加のプライマーDBON0379とDBONO380を作製することによりこれらの6塩基が付加された。pMAK upfオリゴとDBONO380オリゴを使用してこれらのファージ用のUHR断片を増幅した。DBON0379オリゴとDBON0358オリゴを使用してNanoLuc断片を増幅した。
PIE法において次のオリゴヌクレオチドを使用した。
pMAK upf:
TTACGCCAAGCTTGGCTGCAACGTGAGTTCCTAGACGACC
pMAK upr:
ATGTTTTTGGCGTCTTCCATATATATTTACCTCCTCTTAGTTGCTATGAACGTTTT
pMAK lucf:
AAAACGTTCATAGCAACTAAGAGGAGGTAAATATATATGGAAGACGCCAAAAACAT
MAK lucr:
ATTCAATTATCCTATAATTATTACAATTTGGACTTTCCGC
pMAK dnf:
GCGGAAAGTCCAAATTGTAATAATTATAGGATAATTGAAT
pMAK dnr:
ACGACGGCCAGTGAATTCCCAGTTACTAACTGCTCTAATG
pMAK dnr P100:
ACGACGGCCAGTGAATTCCCAGTTACTAACTGTTCTAATG
DBONO360:CCTCTAGCTCAAATTAACGCATCTGT
DBON0361:TGGCTCTACATGCTTAGGGTTCC
DBON0356:
TCTTCGAGTGTGAAGACCATATATATTTACCTCCTCTTAGTTGC
DBON0357:
CTAAGAGGAGGTAAATATATATGGTCTTCACACTCGAAGATTT
DBON0358:
ATTCAATTATCCTATAATTATTACGCCAGAATGCGTTCGC
DBON0359:
GCGAACGCATTCTGGCGTAATAATTATAGGATAATTGAATAAA
DBON0379:
AAAACGTTCATAGCAACTAATAATAAGAGGAGGTAAATATATATGGTCTTCAC ACTCGAAGATTT
DBONO380:
ATATTTACCTCCTCTTATTATTAGTTGCTATGAACGTTTTTTACAGG
DBON0382:
ACGACGGCCAGTGAATTCCCTCGTGGTGTTCTGACTCCCG。
その後の実験において、前記方法に対して幾つかの改変を行った。多くの場合にPTVの構築中にDHR断片が構築されたプラスミドから失われていることが明らかになった。これは、DBON0382オリゴを利用して使用する断片の長さを短くすることにより克服された。
改変アプローチにおいて、前記組換え溶菌液の力価を決定した後に時には次のように濃縮工程を実施し、その濃縮工程を用いてNanoLucファージを作製した。
PIE溶菌液を200μlの体積で培養するために96ウェルマイクロタイタープレートを使用した。FF溶菌液については1e6pfu/溶菌液(5e6pfu/ml)の濃度で96本の溶菌液、1e5pfu/溶菌液の濃度で96本の溶菌液、及び1e4pfu/溶菌液の濃度で95本の溶菌液を作製することが最初のステップであった。NanoLucファージについては前記組換え溶菌液の組換え効率が著しく高いこと、及び1e0pfu/溶菌液まで下げた希釈物を使用することができることがわかった。50rpmで撹拌して30℃で一晩培養することによりこれらの溶菌液を作製した。適切なルシフェラーゼアッセイシステム(ff又はNanoGlo)を使用してそれらの溶菌液をアッセイした。新しい細胞を感染させるためにそれらの溶菌液を使用する代わりに、溶菌液自体のバックグランドシグナルが組換えファージの存在の指標であることがわかった。
最少の数のファージから作製される溶菌液が特定されたところでその溶菌液を使用して、より少ないファージを使用する新しい96ウェル溶菌液を用意した。1:10〜1:100という適切な組換え頻度が達成されたところでそれらのファージを寒天プレート上に蒔いて上に記載されるように単一性プラークを単離した。
これらの方法を使用してffルシフェラーゼをコードする異種性オープン・リーディング・フレーム又はNanoLucルシフェラーゼをコードするオープン・リーディング・フレームのどちらかを備える組換えファージを作製した。それらの遺伝子操作ファージにおけるその挿入された積載物と周囲の配列の完全性を確認するため、PCRにより断片を増幅し、配列を解析した。この断片はその挿入された配列にまたがり、cps遺伝子から始まり、ホタル遺伝子又はNanoLuc遺伝子を越え、下流配列にわたる。DBON0398オリゴとpMAK uprオリゴを使用して完全長cps遺伝子もPCR増幅した:
DBON0398:TGCTATATTATAGGAACATGGGAA.
DBON0273オリゴ、DBON0398オリゴ、及びpMAK uprオリゴを使用してその遺伝子の配列を解析した。
次のプライマーを使用してPCR断片を増幅した。
DBON0273:TGCTTACATGCCAGTAGGGGT;及び
DBON0382:
ACGACGGCCAGTGAATTCCCTCGTGGTGTTCTGACTCCCG。
次のオリゴを使用してNanoLucファージの配列を解析した。
DBON0273;
DBON0382;
DBON0361:TGGCTCTACATGCTTAGGGTTCC;
DBONO360:CCTCTAGCTCAAATTAACGCATCTGT;
DBON0362:GTATGAAGGTCTGAGCGGCG、及び
DBON0363:GATCTGGCCCATTTGGTCGC。
次のオリゴを使用してホタルファージの配列を解析した。
DBON0273;
DBON0382;
DBONO360;
DBON0361;
DBON0274:CGCATAGAACTGCCTGCGTC;
DBON0151:CACCCCAACATCTTCGACGC;及び
DBON0152:GCGCAACTGCAACTCCGATA。
Genewiz社によってシーケンシングが実施された。Geneiousソフトウェアパッケージを使用してアラインメントを行い、各ファージについてコンセンサス配列を作製した。
次の遺伝子操作したファージが作製され、挿入部位領域の配列が上に記載されるように解析されている。
挿入されたホタルルシフェラーゼを含むファージ:
LP48::ffluc(配列番号23);
LP99::ffluc(配列番号24);
LP101::ffluc(配列番号25);
LP124::ffluc(配列番号26);
LP125::ffluc(配列番号27);
LP143::ffluc(配列番号28);
A511::ffluc(配列番号29);及び
P100::ffluc(配列番号30)。
挿入されたNanoLucルシフェラーゼを含むファージ:
LP124::nluc(配列番号31);
LP125::nluc(配列番号32);
A511::nluc(配列番号33);
P100::nluc(配列番号34)。
挿入されたホタルルシフェラーゼ・コード配列を備える前記ファージの挿入部位領域が図3において整列している。各配列は次の部分を含む。

挿入されたNanoLucルシフェラーゼ・コード配列を備える前記ファージの挿入部位領域が図4において整列している。各配列は次の部分を含む。

各ファージのcpsオープン・リーディング・フレームとコードされるタンパク質は次の通りである。

cps遺伝子配列が図1において整列しており、タンパク質配列が図2において整列している。前記の遺伝子操作したファージのcps遺伝子は比較的に高い程度の相同性を示している。
上に記載される方法を用いて上記のファージの全てを遺伝子操作した。部分的ゲノム配列により、LP48、LP124、及びLP125用のPTVを作製するためにA511に使用されるプライマーを使用することができることが示された。LP99、LP101又はLP143のときにはゲノム配列が利用可能ではなかった。A511 PTVプライマーを使用してPTV構築用の適切な断片をA511と同様に増幅することができた。このことはそれらのファージにまたがるcps遺伝子領域の間の相同性を反映している。ルシフェラーゼ遺伝子挿入部位はA511::fflucと同じ場所(cps遺伝子終止コドンTAAの後)であった。
実施例6:リステリアファージ混合物の宿主範囲の特徴解析
2つの異なる遺伝的積載物であるホタルルシフェラーゼとナノルシフェラーゼで前記ファージのゲノムを操作した後にこれらのファージの宿主範囲を再検査してそれらのゲノム改変がそれらのファージの適応性に影響していないこと、又はリステリア株宿主パネルにわたる包括度を提供するそれらのファージの能力を損ねていないことを確かめた。遺伝子操作ファージを前記液体ベース宿主範囲アッセイにおいて検査し、非改変型バクテリオファージと比較した。それらの遺伝子操作バクテリオファージは非改変型野生型と比較してそれらのファージの宿主範囲の変化を示さなかった(表4)。
バクテリオファージの個々の宿主範囲プロファイルを組み合わせるとリステリア属の必要な包括度を提供するそれらのバクテリオファージが特定されたことにより、それらのファージが混合感染において使用されるときに期待される相加的包括度を提供するかどうかという疑問、又は感染における追加のバクテリオファージの存在が感受性株に感染する単一のバクテリオファージの能力を低下させるかどうかという疑問が生じた。このことを検討するために前記液体ベース宿主範囲アッセイにおいて透明化をもたらすバクテリオファージカクテルの能力についてバクテリオファージの混合物(カクテル)を検査した。これらの感染のため、前記カクテル内のそれぞれ等量のファージからなる1×105pfu(すなわち、二成分ファージカクテルがそれぞれについて5×104pfuの2つの構成ファージからなる)という一定の濃度でファージの終濃度が維持された。カクテル(二成分、三成分、又は四成分バクテリオファージカクテルのいずれか)中のバクテリオファージの組合せが宿主範囲の喪失を引き起こすことはなく、個々のバクテリオファージの宿主範囲の予期される相加的効果をもたらした(表4)。遺伝子操作されたホタルルシフェラーゼ発現バクテリオファージとNanolucルシフェラーゼ発現バクテリオファージの両方が遺伝子操作されていないバクテリオファージと比べて変化した液体ベースの宿主範囲を有しなかったので、前記バクテリオファージの相加的効果はそれらのゲノム改変と無関係であった。
実施例7:マーカーベースの宿主範囲に対する液体ベースの宿主範囲の比較
活発に増殖する培養物を透明化するバクテリオファージの能力は、前記バクテリオファージが特定の株に感染する能力に加えて、特定の株の増殖速度及びバクテリオファージの複製速度をはじめとする多数の要因によって決定される。したがって、本明細書において開示される液体培養法において使用される培養物透明化測定出力値は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えファージに細菌株を曝露し、且つ、マーカー産生についてアッセイすることにより決定され得る宿主範囲よりも限定的である可能性がある。そのようなマーカーの一例はルシフェラーゼである。したがって、前記液体ベース宿主範囲アッセイと感染ベースのルシフェラーゼ検出アッセイの両方によって宿主範囲をLP124:nlucファージについて決定した。感染ベースのアッセイを実施するため、リステリア宿主パネル株コレクションの培養をブレインハートインフュージョン(BHI)寒天プレート上で始め、2mlの96ディープウェルディッシュ中の1mlのBHI液の中に単一性コロニーを接種し、滅菌通気性滅菌膜で覆い、30℃で16時間培養した。それらの96ウェルプレートの16時間培養物の各々を198μlのBHIの中に1:10,000の割合で希釈した。感染のため、12.5μlの前記培養希釈物を不透明の発光リーダープレート中の1×107pfu/mlの濃度の12.5μlのLP124:nlucに添加して混合し、30℃で3時間保温した。3時間後に製造業者の推奨に従ってPromega NanoGlo反応を用いてPromega Glomax96ウェルプレートリーダーを使用して発光レベルを検出した。
表5は前記の2つの方法によって決定された宿主範囲を示している。非感染培養物のOD600に対する感染培養物OD600の比率が0.4未満である場合に株が透明化アッセイについて宿主範囲内にあると見なした。ルシフェラーゼ検出ベースの宿主範囲について、アッセイ株を高RLU株(表5、濃い灰色の影)、中RLU株(表5、明るい灰色の影)、及び低RLU株(表5、影無し)の3つのカテゴリーに階層化した。そのアッセイの成績に基づき、RLU測定値が10,000ランダム・ライト・ユニット(RLU)を超える(表5、明るい灰色の影)場合に株が前記バクテリオファージの宿主範囲内にあると見なした。このルシフェラーゼ活性カットオフ値は細菌アッセイにおいて有用なレベルの感度を特徴づけるので使用された。前記液体ベースの宿主範囲透明化のこれらの基準に基づくと、LP124は検査したリステリア株の50.5%(276株のうちの140株)を透明化することにより広い宿主範囲を示す。ルシフェラーゼ検出アッセイにより、検査したリステリア株の78.2%(276株のうちの216株)が高RLUレベルを示した。
リステリア宿主パネルの培養物を透明化するLP124::nlucの能力とRLU出力値との間の比較により、マーカー発現を使用して測定された宿主範囲が前記液体ベースの宿主範囲を使用して限定された宿主範囲よりも広いことが示される。このことは幾つかの理由によるものであり得た。第一に、感染によって透明化されないが、光を発する細菌株は、前記バクテリオファージが感染し、複製する能力に勝る増殖速度を有する場合があり得る。この場合では非感染細胞の数がその培養物中のバクテリオファージに勝るので、その株が完全にそのバクテリオファージに負けることは決してない。第二に、そのバクテリオファージは最初の感染ステップ(すなわち、結合、DNAの注入、及びウイルスタンパク質の翻訳)を行うことができるが、感染過程(すなわち、ビリオンの構築、細胞からの放出)を完了することができない場合があり得る。バクテリオファージの生活環を別々のステップに分けることができるので、バクテリオファージは、培養物を透明化することなく、又は追加的なバクテリオファージを産生することなく、ファージがコードするタンパク質、この場合はルシフェラーゼを産生することができる。バクテリオファージを産生することなくルシフェラーゼを産生するその他の株はバクテリオファージの宿主範囲の古典的な定義の中に当てはまらない一方で、マーカーをコードする異種性核酸配列を備えるファージを使用して標的細菌を検出する方法において問題となる宿主範囲はマーカー産生を維持する種類の細菌であるので、それらの株は本開示の目的に適した宿主範囲の定義に含まれる。前記遺伝子操作バクテリオファージを使用すると観察されるこの増加した宿主範囲はその遺伝子操作過程の有利な副産物であり、リステリア宿主パネル用に演繹的にその宿主範囲を決定することはできない。
液体ベースの培養物のバクテリオファージが透明化することができない細菌株においてそのバクテリオファージが光を発する能力によって生じる1つの可能性がある懸念は、他の標的外細菌属も遺伝子操作ファージの存在下でルシフェラーゼを産生することができることである。これらの細菌種は、バクテリオファージ感染に応答してバクテリオファージを産生することができないため、これらのファージの宿主範囲内にあると見なされなかった。しかしながら、前記遺伝子操作ファージによる感染の初期段階を検出するための上昇した感度の結果、少なくとも理論的には、例えば液体培養法を使用して宿主と特定されていない細菌の株においてマーカー(この場合はルシフェラーゼであり、発光によってアッセイされる)が産生されることになり得る。この問題に対応するため、リステリアに密接に関連する細菌種のパネルを構築した(表6)。このパネルは系統学的にリステリアに類似の他のグラム陽性生物から構成された。これらの株が前記遺伝子操作バクテリオファージの存在下で発光することができるか判定するため、それらの種の各々を適切な培養条件下で16時間培養した(表6)。それらの株を105cfu/mlの濃度にまで希釈し、次に90μlの細胞を1×107pfu/mlのバクテリオファージカクテルの10μlと混合し、30℃で3時間培養した。その後、標準的プロトコルを使用してルシフェラーゼの存在についてそれらの反応を測定した。検査された細菌種の中で検出可能なレベルのRLUを有したものは無く(表6)、前記バクテリオファージが透明化しない株においてRLUを示すそれらのバクテリオファージの能力は、バクテリオファージレポーターベースアッセイの精度を低下させる厳密な意味での標的外効果ではないことを示した。
第二の問題は、アッセイにおいてリステリア細菌種と非リステリア細菌種が共存するときに系統学的にリステリアに類似のこれらの細菌種がリステリアを検出する前記遺伝子操作バクテリオファージの感度を低下させるかどうかということであった。この可能性を検討するため、関連の細菌種を上記のように培養し、105cfu/mlの濃度にまで希釈した。リステリア株の培養をブレインハートインフュージョン(BHI)寒天プレート上で始め、5mlのBHI液の中に単一性コロニーを接種し、30℃で16時間培養した。一晩培養した培養物を新しい0.5×BHI培地の中に1:5の割合で希釈し、撹拌振盪機において200rpmで振盪して30℃で2時間培養した。2時間後にその培養物の10倍段階希釈物を作製した。前記検査を実施するため、全体で約10cfuを表すはずである前記リステリア段階希釈物の10μlを20μlの潜在的に阻害性の細菌種及び10μlのバクテリオファージカクテル(A511::nluc/LP124::nluc/P100::nluc)と混合し、その混合物を30℃で3時間保温した。その保温後に、示唆されたようにPromega Glomax 20/20ルミノメーターとPromega NanoGlo反応を用いてルシフェラーゼの存在についてその反応をアッセイした。これらのアッセイにより、104大きい数の競合性細菌が存在する中でリステリアを検出する能力の低下は存在しないことが示され(表6)、そのアッセイの感度は試料中の非標的細菌の存在によって影響されないことが示された。
細菌のこの選択は環境試料採取中に存在し得る細菌の限定的なセットであり、それらの細菌の全てを表してはいなかった。前記バクテリオファージカクテルの感度と精度を低下させ得るより包括的な細菌種試料を作製するため、食品加工工場から環境試料を採取し、環境スワッブから細菌種を単離して前記アッセイの成績に対するこれらの種の影響を測定した。存在する細菌種を単離するため、ブレインハートインフュージョン寒天又はR2A寒天の両方に環境試料を蒔き、30℃で一晩培養した。コロニーの形態に基づいてそれらのプレート上に存在する細菌を特定し、BHI寒天プレート上で純化のための培養を始めた。それらの細菌種の純粋培養物をBHI培地中に30℃で16時間培養した。それらの培養物を105cfu/mlの濃度まで希釈し、前記バクテリオファージカクテルが存在する中でのルシフェラーゼの産生と前記バクテリオファージカクテルによるリステリア感染の阻害の両方について上記のように検査した。グラム陽性細菌とグラム陰性細菌の両方から構成される細菌種のうち、前記バクテリオファージの存在下でどのようなルシフェラーゼの産生でも示すものは無かった(表7)。さらに、採取試料が存在する中でのリステリアの培養によってどのようなルシフェラーゼの産生の低下も示すことができず、環境的に採取された細菌によって前記アッセイの感度又は精度は低下しないことが示された。
実施例8:ファージ組成物の設計
前記液体ベース宿主範囲アッセイと比較して前記RLUベースのルシフェラーゼ検出アッセイにより観察された宿主範囲の増加により、バクテリオファージの宿主範囲の間の差異を識別するための新規の方法が明らかにされた。さらに、ファージ宿主範囲を評価する手段としての前記RLUベースのルシフェラーゼ検出アッセイにより、標的細菌を検出する方法の条件に類似の条件の下で遺伝子操作バクテリオファージにより特定された標的細菌を非常に正確に評価することが可能になる。この情報を使用することができる一つの方法は、有用な累積的宿主範囲を有するファージ混合物を作製するために組み合わせることができるファージの有用な組合せを特定することである。
バクテリオファージカクテル中にLP124::nlucを含むことの相加的効果を判定するため、リステリア宿主範囲パネルの一部についてA511::nlucとLP124::nlucの間でRLUベースのルシフェラーゼ検出アッセイを比較した。LP124::nlucはA51l:nluc(96株のうち37株を検出、38.5%)と比較して広いRLUベースの宿主範囲(96株のうち77株を検出、80.2%)を有した(表8)。また、LP124:nlucは96株のうちの73株(76%)においてA511:nlucと比較して100倍より高いRLU値をもたらす。LP124:nluc感染体に由来するこの増加したRLU出力値は、A511とLP124:nlucの両方を含むバクテリオファージカクテルがA511:nluc単独よりも高い感度と精度を有することを予測する。
A511とP100が存在する中でもたらされるRLUのレベルをLP124::nlucが上昇させるかどうか検討するため、二成分ファージカクテル(A511::nluc/P100::nluc)と三成分ファージカクテル(A511::nluc/P100::nluc/LP124::nluc)の両方で感染させられた試料の間でRLU値を比較した。このことを検討するため、UVM培地中で培養した1mlの複合環境試料を遠心分離により沈降させた。上清を除去し、1×107の総バクテリオファージ濃度の100μlの前記二成分ファージカクテル又は前記三成分ファージカクテルのどちらかの中に細胞を再懸濁し、30℃で培養した。Promega NanoGlo試薬とPromega 20/20ルミノメーターを使用することによりRLUレベルを測定した。リステリア宿主パネルについては、前記二成分ファージカクテルよりも前記三成分ファージカクテルが存在するときに環境試料は高いレベルのRLUを示した(表9)。その感染のRLU出力値のこの増加は、P100::nlucとA511::nlucだけに対してLP124::nlucを存在させることによる明らかな利点を示している。
前記二成分ファージカクテルと比較した前記三成分ファージの増加した宿主範囲と上昇したRLU出力値により、環境試料に対する有用な包括度がA511::nlucとLP124::nlucのカクテルによりもたらされることが示唆された。食品加工工場に関係するリステリアを特定する前記カクテルの能力を判定するため、米国内の様々な食品加工工場において環境試料採取を実施した。これらの食品加工工場は水産物加工工場、乳加工工場、食肉加工工場、及び農産物加工工場を代表し、それらの加工工場の所在地について地理的に様々であった。環境採取を実施した後で改変USDA単離法を用いてそれらの環境試料中に存在するリステリアを単離した。それらのリステリアの培養をBHI寒天プレート上で始め、単一性コロニーを使用して2mlのディープウェルディッシュ中の1mlの0.5×BHI培地に接種し、滅菌通気性膜で覆い、30℃で16時間培養した。播種した96ウェルの16時間培養物の各々を198μlのBHI中に1:10,000の割合で希釈した。感染のため、12.5μlの前記培養希釈物を不透明の発光リーダープレート中の1×107pfu/mlの総バクテリオファージ濃度のA511::nlucとLP124::nlucを含む12.5μlのバクテリオファージカクテルに添加して混合し、30℃で3時間保温した。3時間後に製造業者の推奨に従ってPromega NanoGlo反応を用いてPromega Glomax96ウェルプレートリーダーを使用して発光レベルを検出した。同時に液体ベース宿主範囲アッセイを実施して培養物透明化に対してそのRLU出力値を比較した。
前記液体ベース宿主範囲アッセイに基づき、前記バクテリオファージカクテルは100株のうちの25株(25%)において細菌培養物を透明化することができた。透明化のこのレベルの低下は、リステリア宿主範囲パネル内の検査された一般的な研究室単離株と比較して速い環境的に単離された株の増殖速度に起因する。RLUベース宿主範囲アッセイにより100株のうちの75株(75%)が特定された(表10)。これらの環境試料は複雑な微生物学的群落を代表しており、環境試料当たり複数のリステリア単離株を有した。これらの微生物学的群落内にリステリアの複数の株が存在することにより前記アッセイの感度が改善される。この例ではスポンジを使用して環境試料を採取しており、それらのスポンジを培地と共に最大で24時間まで保温し、その後でアリコットを取出し、検出する細菌集団の存在又は不在についてそのアリコットをアッセイした。同じ環境試料から特定された個々のリステリア株を特定する前記バクテリオファージカクテルの能力に基づくと、A511とLP124:nlucからなる前記バクテリオファージカクテルにより57個のうち48個(84.2%)のリステリア陽性スポンジを検出することができると予想された。その環境スポンジを培地中で保温し、且つ、前記アッセイを用いてその濃縮試料の試料を検査すると、A511とLP124:nlucを含む前記バクテリオファージカクテルは57個のうち49個(85.9%)のリステリア陽性スポンジを検出することができた。この感度の上昇は、前記バクテリオファージカクテルに対して感受性を有するリステリア株を検出する前記アッセイの感度は、前記バクテリオファージカクテルの宿主範囲内のものをはじめとする複数のリステリア株の存在のために低下しないことを示している。






















































































本発明は、その特定の実施形態を参照して説明したが、様々な変更を行うことができ、均等物が本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく置換されていてもよいことは、当業者によって理解されるべきである。加えて、多くの修飾が、本発明の目的、精神及び範囲に、特定の状況、材料、物質の粗製、プロセス、プロセスステップまたはステップを適合させるようにされてもよい。すべてのこのような修飾は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。



  1. 試料を提供すること;
    第1セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第1マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第1の種類のファージに前記試料を曝露すること;
    第2セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第2マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第2の種類のファージに前記試料を曝露すること;及び
    該曝露された試料の中の第1マーカーと第2マーカーの存在についてアッセイすること
    を含む、標的細菌を検出する方法。

  2. 前記試料中の第1マーカーの検出が、該試料中の標的細菌の第1セットの細菌の存在を表す、請求項1に記載の方法。

  3. 前記試料中の第2マーカーの検出が、該試料中の標的細菌の第2セットの細菌の存在を表す、請求項1に記載の方法。

  4. 第1マーカーと第2マーカーが同じであり、前記試料中のマーカーの検出が該試料中の第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌のうちの少なくとも一方の細菌の存在を表す、請求項1に記載の方法。

  5. 第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌が、独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも2種を含む、請求項1に記載の方法。

  6. 第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌が、独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも3種を含む、請求項5に記載の方法。

  7. 第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌が、独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも4種を含む、請求項6に記載の方法。

  8. 一つの属の細菌がリステリアである、請求項5に記載の方法。

  9. 第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌が、共通して少なくとも1種の細菌を含む、請求項1に記載の方法。

  10. 第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌が、共通して少なくとも2種の細菌を含む、請求項1に記載の方法。

  11. 第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌が、共通して少なくとも3種の細菌を含む、請求項1に記載の方法。

  12. 第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌が、共通して少なくとも4種の細菌を含む、請求項1に記載の方法。

  13. 種が、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、リステリア・ゼーリゲリ(Listeria seeligeri)、リステリア・イワノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・グレイ(Listeria grayi)、リステリア・マルティイ(Listeria marthii)、リステリア・ロコウルティ(Listeria rocourti)及びリステリア・ウェルシメリ(Listeria welshimeri)から選択される、請求項8に記載の方法。

  14. 種が、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択される、請求項13に記載の方法。

  15. 標的細菌が、リステリア・イノキュアの11、22、37、及び56から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備える、請求項13に記載の方法。

  16. 標的細菌が、リステリア・イノキュアの少なくとも4種類の対立遺伝子型を備える、請求項15に記載の方法。

  17. リステリア・イノキュアの少なくとも4種類の対立遺伝子型が、11、22、37、及び56である、請求項16に記載の方法。

  18. 標的細菌が、リステリア・モノサイトゲネスのDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dから選択される少なくとも1種類のリボタイプを備える、請求項13に記載の方法。

  19. 標的細菌が、リステリア・モノサイトゲネスの少なくとも19種類のリボタイプを備える、請求項19に記載の方法。

  20. リステリア・モノサイトゲネスの少なくとも19種類のリボタイプが、DUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dである、請求項19に記載の方法。

  21. 標的細菌が、リステリア・ゼーリゲリの3、20、24、及び35から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備える、請求項20に記載の方法。

  22. 標的細菌が、リステリア・ゼーリゲリの少なくとも4種類の対立遺伝子型を備える、請求項21に記載の方法。

  23. リステリア・ゼーリゲリの少なくとも4種類の対立遺伝子型が、3、20、24、及び35である、請求項22に記載の方法。

  24. 標的細菌が、リステリア・ウェルシメリの15、27、32、及び89から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備える、請求項13に記載の方法。

  25. 標的細菌が、リステリア・ウェルシメリの少なくとも4種類の対立遺伝子型を備える、請求項24に記載の方法。

  26. リステリア・ウェルシメリの少なくとも4種類の対立遺伝子型は、15、27、32、及び89である、請求項26に記載の方法。

  27. 第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌が、共通して少なくとも1種を含む、請求項1に記載の方法。

  28. 第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌が、共通して少なくとも2種を含む、請求項27に記載の方法。

  29. 第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌が、共通して少なくとも3種を含む、請求項28に記載の方法。

  30. 第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌が、共通して少なくとも4種を含む、請求項29に記載の方法。

  31. 第1セットの標的細菌が、同じ属の全てのメンバーである、請求項1に記載の方法。

  32. 第2セットの標的細菌が、同じ属の全てのメンバーである、請求項1に記載の方法。

  33. 標的細菌の全てがリステリアである、請求項1に記載の方法。

  34. 標的細菌が、セレウス菌(Bacillus cereus)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、枯草菌(Bacillus subtilis)、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム(Enterococcus faceium)、腸内連鎖球菌(Enterococcus hirae)、コクリア・バリアンス(Kocuria varians)、クルチア・ギブソニイ(Kurthia gibsonii)、クルチア・ゾッフィー(Kurthia zopfii)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・ガロイティクス(Streptococcus galloyticus)、ラクトバシラス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバシラス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバシラス・ラクトゥス(Lactobacillus lactus)、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ミクロコッカス・ルツエス(Micrococcus lutues)、シュードモナス・プロトジェンス(Pseudomonas protogens)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、アエロモナス属種(Aeromonas sp)、セラチア・リクファシエンス(Serratia liquefaciens)、セラチア・プロテアマキュランス(Serratia proteamaculans)、セラチア・リクファシエンス(Serratia liquefaciens)、バシラス科(Bacillaceae)の細菌、セラチア・プロテアマキュランス(Serratia proteamaculans)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、シュードモナス・ポアエ(Pseudomonas poae)、シュードモナス属種(Pseudomonas sp)、シュードモナス・フラギ(Pseudomonas fragi)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、セラチア属種(Serratia sp)、セラチア・グリメシイ(Serratia grimesii)、ハフニア属種(Hafnia sp)、セラチア・プロテアマキュランス(Serratia proteamaculans)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、クリセオバクテリウム属種(Chryseobacterium sp)、シュードモナス・フラギ(Pseudomonas fragi)、及び腸内細菌科(Enterobacteriaceae)を含まない、請求項1に記載の方法。

  35. 第3セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第3マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第3の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む、請求項1に記載の方法。

  36. 方法において使用される少なくとも1種類のファージが、A511、P100、LP40、LP44、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125、及びLP143、及びそれらの派生株から選択される、請求項1に記載の方法。

  37. 方法において使用される全ての種類のファージが、A511、P100、LP40、LP44、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125、及びLP143、及びそれらの派生株から選択される、請求項1に記載の方法。

  38. 第1マーカーがスクリーニング可能なマーカーである、請求項1に記載の方法。

  39. 第1マーカーがルシフェラーゼである、請求項38に記載の方法。

  40. ルシフェラーゼが配列番号2に対して少なくとも70%同一である、請求項39に記載の方法。

  41. 第1の種類のファージが、LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、及びP100::fflucから選択される、請求項40に記載の方法。

  42. ルシフェラーゼが配列番号4に対して少なくとも70%同一である、請求項39に記載の方法。

  43. 第1の種類のファージが、LP40:nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc、及びP100::nlucから選択される、請求項42に記載の方法。

  44. 第2マーカーがスクリーニング可能なマーカーである、請求項1に記載の方法。

  45. 第2マーカーがルシフェラーゼである、請求項44に記載の方法。

  46. ルシフェラーゼが配列番号2に対して少なくとも70%同一である、請求項45に記載の方法。

  47. 第2の種類のファージが、LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、及びP100::fflucから選択される、請求項46に記載の方法。

  48. ルシフェラーゼが配列番号4に対して少なくとも70%同一である、請求項45に記載の方法。

  49. 第2の種類のファージが、LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、及びP100::fflucから選択される、請求項48に記載の方法。

  50. 第1の種類のファージと第2の種類のファージに対して試料を同時に曝露することを含む、請求項1に記載の方法。

  51. 試料が環境試料である、請求項1に記載の方法。

  52. 第1マーカーが試料中に検出され、該試料中の標的細菌の第1セットの細菌の存在を表す、請求項1に記載の方法。

  53. 第2マーカーが試料中に検出され、該試料中の標的細菌の第2セットの細菌の存在を表す、請求項1に記載の方法。

  54. 第1マーカーと第2マーカーが同じであり、該マーカーが試料中に検出され、該試料中の第1セットの標的細菌と第2セットの標的細菌のうちの少なくとも一方の細菌の存在を表す、請求項1に記載の方法。

  55. 環境試料に対するアッセイの偽陽性率が、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下である、請求項1に記載の方法。

  56. 環境試料に対するアッセイの偽陰性率が、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下である、請求項1に記載の方法。

  57. 試料が、ファージに曝露される前に代謝促進条件に曝露される、請求項1に記載の方法。

  58. 標的細菌に感染することができるファージに試料を曝露する前の一時期に該試料を代謝促進条件下でインキュベートすることをさらに含む、請求項1に記載の方法。

  59. 試料を提供すること;
    マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも1種類の組換えリステリアファージであって、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される上記組換えリステリアファージに試料を曝露すること;及び
    曝露された試料中の該マーカーの存在についてアッセイすること
    を含む、標的細菌を検出する方法。

  60. マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも1種類の組換えリステリアファージであって、組換えA511と組換えP100から選択される組換えリステリアファージに試料を曝露することをさらに含む、請求項59に記載の方法。

  61. 試料中のマーカーの検出が該試料中のリステリアの存在を表す、請求項60に記載の方法。

  62. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、リステリア・ゼーリゲリ(Listeria seeligeri)、リステリア・イワノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・グレイ(Listeria grayi)、リステリア・マルティイ(Listeria marthii)、リステリア・ロコウルティ(Listeria rocourti)、及びリステリア・ウェルシメリ(Listeria welshimeri)から選択されるリステリア属の少なくとも1つの種を含む、請求項59に記載の方法。

  63. 試料中のマーカーの検出が、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、リステリア・ゼーリゲリ(Listeria seeligeri)、リステリア・イワノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・グレイ(Listeria grayi)、リステリア・マルティイ(Listeria marthii)、リステリア・ロコウルティ(Listeria rocourti)、及びリステリア・ウェルシメリ(Listeria welshimeri)から選択されるリステリア属の少なくとも1つの種の該試料における存在を表す、請求項62に記載の方法。

  64. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、リステリア・ゼーリゲリ(Listeria seeligeri)、及びリステリア・ウェルシメリ(Listeria welshimeri)から選択されるリステリア属の少なくとも1つの種を含む、請求項59に記載の方法。

  65. 試料中のマーカーの検出が、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、リステリア・ゼーリゲリ(Listeria seeligeri)、及びリステリア・ウェルシメリ(Listeria welshimeri)から選択されるリステリア属の少なくとも1つの種の該試料における存在を表す、請求項59に記載の方法。

  66. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュアの11、22、37、及び56から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備え、試料中のマーカーの検出が、リステリア・イノキュアの11、22、37、及び56から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型の存在を表す、請求項59に記載の方法。

  67. 少なくとも1種類のリステリアファージが、リステリア・イノキュアsigB対立遺伝子型11、22、37、及び56に感染することができる、請求項66に記載の方法。

  68. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・モノサイトゲネスのDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dから選択される少なくとも1種類のリボタイプを備え、試料中の前記マーカーの検出が、リステリア・モノサイトゲネスのDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dから選択される少なくとも1種類のリボタイプの存在を表す、請求項59に記載の方法。

  69. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・モノサイトゲネスのリボタイプDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dを含む、請求項68に記載の方法。

  70. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・ゼーリゲリの3、20、24、及び35から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備え、試料中のマーカーの検出が、リステリア・ゼーリゲリの3、20、24、及び35から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型の存在を表す、請求項59に記載の方法。

  71. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・ゼーリゲリsigB対立遺伝子型3、20、24、及び35を含む、請求項70に記載の方法。

  72. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・ウェルシメリの3、20、24、及び35から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備え、試料中のマーカーの検出が、リステリア・ウェルシメリの15、27、32、及び89から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型の存在を表す、請求項59に記載の方法。

  73. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・ウェルシメリsigB対立遺伝子型15、27、32及び89を含む、請求項72に記載の方法。

  74. 標的細菌が、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、リステリア・ゼーリゲリ(Listeria seeligeri)、及びリステリア・ウェルシメリ(Listeria welshimeri)から選択されるリステリア属の少なくとも2つの種を含む、請求項59に記載の方法。

  75. 標的細菌が、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、リステリア・ゼーリゲリ(Listeria seeligeri)、及びリステリア・ウェルシメリ(Listeria welshimeri)から選択されるリステリア属の少なくとも3つの種を含む、請求項74に記載の方法。

  76. 標的細菌が、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、リステリア・ゼーリゲリ(Listeria seeligeri)、及びリステリア・ウェルシメリ(Listeria welshimeri)から選択されるリステリア属の少なくとも4つの種を含む、請求項75に記載の方法。

  77. 標的細菌が、セレウス菌(Bacillus cereus)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、枯草菌(Bacillus subtilis)、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム(Enterococcus faceium)、腸内連鎖球菌(Enterococcus hirae)、コクリア・バリアンス(Kocuria varians)、クルチア・ギブソニイ(Kurthia gibsonii)、クルチア・ゾッフィー(Kurthia zopfii)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・ガロイティクス(Streptococcus galloyticus)、ラクトバシラス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバシラス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバシラス・ラクトゥス(Lactobacillus lactus)、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ミクロコッカス・ルツエス(Micrococcus lutues)、シュードモナス・プロトジェンス(Pseudomonas protogens)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、アエロモナス属種(Aeromonas sp)、セラチア・リクファシエンス(Serratia liquefaciens)、セラチア・プロテアマキュランス(Serratia proteamaculans)、セラチア・リクファシエンス(Serratia liquefaciens)、バシラス科(Bacillaceae)の細菌、セラチア・プロテアマキュランス(Serratia proteamaculans)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、シュードモナス・ポアエ(Pseudomonas poae)、シュードモナス属種(Pseudomonas sp)、シュードモナス・フラギ(Pseudomonas fragi)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、セラチア属種(Serratia sp)、セラチア・グリメシイ(Serratia grimesii)、ハフニア属種(Hafnia sp)、セラチア・プロテアマキュランス(Serratia proteamaculans)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、クリセオバクテリウム属種(Chryseobacterium sp)、シュードモナス・フラギ(Pseudomonas fragi)、及び腸内細菌科(Enterobacteriaceae)を含まない、請求項59に記載の方法。

  78. 標的細菌の全てがリステリアである、請求項59に記載の方法。

  79. マーカーがスクリーニング可能なマーカーである、請求項59に記載の方法。

  80. マーカーがルシフェラーゼである、請求項79に記載の方法。

  81. ルシフェラーゼが配列番号2に対して少なくとも70%同一である、請求項80に記載の方法。

  82. ファージが、LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、及びP100::fflucから選択される、請求項81に記載の方法。

  83. ルシフェラーゼが配列番号4に対して少なくとも70%同一である、請求項80に記載の方法。

  84. ファージが、LP40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc、及びP100::nlucから選択される、請求項83に記載の方法。

  85. 試料が環境試料である、請求項59に記載の方法。

  86. マーカーが試料中に検出され、試料中の標的細菌の第1セットの細菌の存在を表す、請求項59に記載の方法。

  87. 環境試料に対するアッセイの偽陽性率が、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下である、請求項59に記載の方法。

  88. 環境試料に対するアッセイの偽陰性率が、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下である、請求項59に記載の方法。

  89. 試料がファージに曝露される前に代謝促進条件に曝露される、請求項59に記載の方法。

  90. マーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージであって、該組換えリステリアファージが、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される、組換えリステリアファージ。

  91. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ、リステリア・ロコウルティ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも1つの種を含む、請求項90に記載の組換えリステリアファージ。

  92. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも1つの種を含む、請求項91に記載の組換えリステリアファージ。

  93. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュアの11、22、37、及び56から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備え、該マーカーを産生する、請求項91に記載の組換えリステリアファージ。

  94. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュアsigB対立遺伝子型11、22、37、及び56を含む、請求項93に記載の組換えリステリアファージ。

  95. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・モノサイトゲネスのDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dから選択される少なくとも1種類のリボタイプを備える、請求項91に記載の組換えリステリアファージ。

  96. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・モノサイトゲネスのリボタイプDUP−10142、DUP−1030A、DUP−1030B、DUP−1038B、DUP−1039A、DUP−1039B、DUP−1039C、DUP−1042A、DUP−1042B、DUP−1042C、DUP−1043A、DUP−1044A、DUP−1044B、DUP−1044E、DUP−1045B、DUP−1052A、DUP−1053A、DUP−1062A、及びDUP−1062Dを含む、請求項89に記載の組換えリステリアファージ。

  97. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・ゼーリゲリの3、20、24、及び35から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備える、請求項91に記載の組換えリステリアファージ。

  98. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・ゼーリゲリsigB対立遺伝子型3、20、24、及び35を含む、請求項91に記載の組換えリステリアファージ。

  99. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・ウェルシメリの15、27、32、及び89から選択される少なくとも1種類のsigB対立遺伝子型を備える、請求項91に記載の組換えリステリアファージ。

  100. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・ウェルシメリsigB対立遺伝子型15、27、32及び89を含む、請求項99に記載の組換えリステリアファージ。

  101. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ、リステリア・ロコウルティ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも2つの種を含む、請求項90に記載の組換えリステリアファージ。

  102. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ、リステリア・ロコウルティ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも3つの種を含む、請求項95に記載の組換えリステリアファージ。

  103. リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ、リステリア・ロコウルティ、及びリステリア・ウェルシメリを含む、請求項96に記載の組換えリステリアファージ。

  104. リステリアファージの標的細菌が、セレウス菌(Bacillus cereus)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、枯草菌(Bacillus subtilis)、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム(Enterococcus faceium)、腸内連鎖球菌(Enterococcus hirae)、コクリア・バリアンス(Kocuria varians)、クルチア・ギブソニイ(Kurthia gibsonii)、クルチア・ゾッフィー(Kurthia zopfii)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・ガロイティクス(Streptococcus galloyticus)、ラクトバシラス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバシラス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバシラス・ラクトゥス(Lactobacillus lactus)、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ミクロコッカス・ルツエス(Micrococcus lutues)、シュードモナス・プロトジェンス(Pseudomonas protogens)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、アエロモナス属種(Aeromonas sp)、セラチア・リクファシエンス(Serratia liquefaciens)、セラチア・プロテアマキュランス(Serratia proteamaculans)、セラチア・リクファシエンス(Serratia liquefaciens)、バシラス科(Bacillaceae)の細菌、セラチア・プロテアマキュランス(Serratia proteamaculans)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、シュードモナス・ポアエ(Pseudomonas poae)、シュードモナス属種(Pseudomonas sp)、シュードモナス・フラギ(Pseudomonas fragi)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、セラチア属種(Serratia sp)、セラチア・グリメシイ(Serratia grimesii)、ハフニア属種(Hafnia sp)、セラチア・プロテアマキュランス(Serratia proteamaculans)、シュードモナス・フロレセンス(Pseudomonas florescens)、クリセオバクテリウム属種(Chryseobacterium sp)、シュードモナス・フラギ(Pseudomonas fragi)、及び腸内細菌科(Enterobacteriaceae)を含まない、請求項90に記載の組換えリステリアファージ。

  105. リステリアファージの標的細菌の全てがリステリアである、請求項90に記載の組換えリステリアファージ。

  106. マーカーがスクリーニング可能なマーカーである、請求項90に記載の組換えリステリアファージ。

  107. マーカーがルシフェラーゼである、請求項106に記載の組換えリステリアファージ。

  108. ルシフェラーゼが配列番号2に対して少なくとも70%同一である、請求項107に記載の組換えリステリアファージ。

  109. ファージが、LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、及びLP143::fflucから選択される、請求項108に記載の組換えリステリアファージ。

  110. ルシフェラーゼが配列番号4に対して少なくとも70%同一である、請求項107に記載の組換えリステリアファージ。

  111. ファージが、LP40::nluc、LP124::nluc及びLP125::nlucから選択される、請求項110に記載の組換えリステリアファージ。

  112. 配列番号2に対して少なくとも70%同一であるルシフェラーゼをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージであって、該組換えリステリアファージが、組換えA511及びその派生株、組換えP100及びその派生株、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される、組換えリステリアファージ。

  113. ファージが、LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、及びP100::fflucから選択される、請求項112に記載の組換えリステリアファージ。

  114. 配列番号4に対して少なくとも70%同一であるルシフェラーゼをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージであって、該組換えリステリアファージは組換えA511及びその派生株、組換えP100及びその派生株、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される、組換えリステリアファージ。

  115. ファージが、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc、及びP100::nlucから選択される、請求項114に記載の組換えリステリアファージ。

  116. 組換えファージが、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下の偽陽性率で環境試料中に標的細菌を検出する、請求項90に記載の組換えリステリアファージ。

  117. 組換えファージが、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下の偽陰性率で環境試料中に標的細菌を検出する、請求項90に記載の組換えリステリアファージ。

  118. マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも1種類の組換えリステリアファージであって、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される組換えリステリアファージ、及び
    a)炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも1種類の化合物、b)少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、c)少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、d)少なくとも脂質から選択される化合物、e)少なくとも1種類の無機化合物、及びf)少なくとも1種類の有機化合物、のうちの少なくとも1つから選択される少なくとも1種類の非ファージ性成分
    を含む、組成物。

  119. 1,2−プロパンジオール、2−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、b−フェニルエチルアミン、L−アスパラギン酸、L−プロリン、D−アラニン、D−セリン、L−グルタミン酸、L−アスパラギン、D−アスパラギン酸、L−グルタミン、Gly−Asp、D−トレオニン、Gly−Glu、L−セリン、L−トレオニン、L−アラニン、Ala−Gly、Gly−Pro、L−アラビノース、N−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトース、D−トレハロース、D−マンノース、ズルシトール、D−ソルビトール、グリセロール、L−フコース、D,L−a−グリセロール、ホスフェート、D−キシロース、D−マンニトール、D−グルコース−6−リン酸、D−リボース、L−ラムノース、D−フルクトース、a−D−グルコース、マルトース、D−メリビオース、チミジン、a−メチル−D−ガラクトシド、a−D−ラクトース、ラクツロセム(lactulosem) ショ糖、ウリジン、D−グルコース−1−リン酸、D−フルクトース−6−リン酸、b−メチル−D−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、2’−デオキシアデノシン、アデノシン、m−イノシトール、D−セロビオース、イノシン、N−アセチル−D−マンノサミン、D−プシコース、L−リキソース、D−サッカリン酸、コハク酸、D−グルクロン酸、D−グルコン酸、D,L−乳酸、ギ酸、D−ガラクトン酸−g−ラクトン、D,L−リンゴ酸、酢酸、D−グルコサミン酸、a−ケトグルタル酸、a−ケト酪酸、m−酒石酸、a−ヒドロキシグルタル酸−g−ラクトン、a−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、D−リンゴ酸、L−リンゴ酸、p−ヒドロキシフェニル酢酸、m−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、L−ガラクトン酸−g−ラクトン、D−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン20、ツイーン40、ツイーン80のうちの少なくとも1つを含む、請求項118に記載の組成物。

  120. マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも2種類の組換えリステリアファージであって、組換えA511及びその派生株、組換えP100及びその派生株、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される組換えリステリアファージを含む組成物。

  121. a)炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも1種類の化合物、b)少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、c)少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、d)少なくとも脂質から選択される化合物、e)少なくとも1種類の無機化合物、及びf)少なくとも1種類の有機化合物、のうちの少なくとも1つから選択される少なくとも1種類の非ファージ性成分を含む、請求項120に記載の組成物。

  122. 1,2−プロパンジオール、2−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、b−フェニルエチルアミン、L−アスパラギン酸、L−プロリン、D−アラニン、D−セリン、L−グルタミン酸、L−アスパラギン、D−アスパラギン酸、L−グルタミン、Gly−Asp、D−トレオニン、Gly−Glu、L−セリン、L−トレオニン、L−アラニン、Ala−Gly、Gly−Pro、L−アラビノース、N−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトース、D−トレハロース、D−マンノース、ズルシトール、D−ソルビトール、グリセロール、L−フコース、D,L−a−グリセロール、ホスフェート、D−キシロース、D−マンニトール、D−グルコース−6−リン酸、D−リボース、L−ラムノース、D−フルクトース、a−D−グルコース、マルトース、D−メリビオース、チミジン、a−メチル−D−ガラクトシド、a−D−ラクトース、ラクツロセム(lactulosem) ショ糖、ウリジン、D−グルコース−1−リン酸、D−フルクトース−6−リン酸、b−メチル−D−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、2’−デオキシアデノシン、アデノシン、m−イノシトール、D−セロビオース、イノシン、N−アセチル−D−マンノサミン、D−プシコース、L−リキソース、D−サッカリン酸、コハク酸、D−グルクロン酸、D−グルコン酸、D,L−乳酸、ギ酸、D−ガラクトン酸−g−ラクトン、D,L−リンゴ酸、酢酸、D−グルコサミン酸、a−ケトグルタル酸、a−ケト酪酸、m−酒石酸、a−ヒドロキシグルタル酸−g−ラクトン、a−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、D−リンゴ酸、L−リンゴ酸、p−ヒドロキシフェニル酢酸、m−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、L−ガラクトン酸−g−ラクトン、D−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン20、ツイーン40、ツイーン80のうちの少なくとも1つを含む、請求項121に記載の組成物。

  123. マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも1種類の組換えリステリアファージであって、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される組換えリステリアファージ、及び
    a)炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも1種類の化合物、b)少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、c)少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、d)少なくとも脂質から選択される化合物、e)少なくとも1種類の無機化合物、及びf)少なくとも1種類の有機化合物、のうちの少なくとも1つから選択される少なくとも1種類の非ファージ性成分を含む溶液
    を含む、製品。

  124. 1,2−プロパンジオール、2−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、b−フェニルエチルアミン、L−アスパラギン酸、L−プロリン、D−アラニン、D−セリン、L−グルタミン酸、L−アスパラギン、D−アスパラギン酸、L−グルタミン、Gly−Asp、D−トレオニン、Gly−Glu、L−セリン、L−トレオニン、L−アラニン、Ala−Gly、Gly−Pro、L−アラビノース、N−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトース、D−トレハロース、D−マンノース、ズルシトール、D−ソルビトール、グリセロール、L−フコース、D,L−a−グリセロール、ホスフェート、D−キシロース、D−マンニトール、D−グルコース−6−リン酸、D−リボース、L−ラムノース、D−フルクトース、a−D−グルコース、マルトース、D−メリビオース、チミジン、a−メチル−D−ガラクトシド、a−D−ラクトース、ラクツロセム(lactulosem) ショ糖、ウリジン、D−グルコース−1−リン酸、D−フルクトース−6−リン酸、b−メチル−D−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、2’−デオキシアデノシン、アデノシン、m−イノシトール、D−セロビオース、イノシン、N−アセチル−D−マンノサミン、D−プシコース、L−リキソース、D−サッカリン酸、コハク酸、D−グルクロン酸、D−グルコン酸、D,L−乳酸、ギ酸、D−ガラクトン酸−g−ラクトン、D,L−リンゴ酸、酢酸、D−グルコサミン酸、a−ケトグルタル酸、a−ケト酪酸、m−酒石酸、a−ヒドロキシグルタル酸−g−ラクトン、a−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、D−リンゴ酸、L−リンゴ酸、p−ヒドロキシフェニル酢酸、m−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、L−ガラクトン酸−g−ラクトン、D−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン20、ツイーン40、ツイーン80のうちの少なくとも1つを含む溶液を備える容器を含む、請求項123に記載の製品。

  125. マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも2種類の組換えリステリアファージであって、組換えA511及びその派生株、組換えP100及びその派生株、組換えLP40及びその派生株、組換えLP48及びその派生株、組換えLP99及びその派生株、組換えLP101及びその派生株、組換えLP124及びその派生株、組換えLP125及びその派生株、並びに組換えLP143及びその派生株から選択される組換えリステリアファージ、及び
    a)炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも1種類の化合物、b)少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、c)少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、d)少なくとも脂質から選択される化合物、e)少なくとも1種類の無機化合物、及びf)少なくとも1種類の有機化合物、のうちの少なくとも1つから選択される少なくとも1種類の非ファージ性成分を含む溶液
    を含む、製品。

  126. 1,2−プロパンジオール、2−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、b−フェニルエチルアミン、L−アスパラギン酸、L−プロリン、D−アラニン、D−セリン、L−グルタミン酸、L−アスパラギン、D−アスパラギン酸、L−グルタミン、Gly−Asp、D−トレオニン、Gly−Glu、L−セリン、L−トレオニン、L−アラニン、Ala−Gly、Gly−Pro、L−アラビノース、N−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトース、D−トレハロース、D−マンノース、ズルシトール、D−ソルビトール、グリセロール、L−フコース、D,L−a−グリセロール、ホスフェート、D−キシロース、D−マンニトール、D−グルコース−6−リン酸、D−リボース、L−ラムノース、D−フルクトース、a−D−グルコース、マルトース、D−メリビオース、チミジン、a−メチル−D−ガラクトシド、a−D−ラクトース、ラクツロセム(lactulosem) ショ糖、ウリジン、D−グルコース−1−リン酸、D−フルクトース−6−リン酸、b−メチル−D−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、2’−デオキシアデノシン、アデノシン、m−イノシトール、D−セロビオース、イノシン、N−アセチル−D−マンノサミン、D−プシコース、L−リキソース、D−サッカリン酸、コハク酸、D−グルクロン酸、D−グルコン酸、D,L−乳酸、ギ酸、D−ガラクトン酸−g−ラクトン、D,L−リンゴ酸、酢酸、D−グルコサミン酸、a−ケトグルタル酸、a−ケト酪酸、m−酒石酸、a−ヒドロキシグルタル酸−g−ラクトン、a−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、D−リンゴ酸、L−リンゴ酸、p−ヒドロキシフェニル酢酸、m−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、L−ガラクトン酸−g−ラクトン、D−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン20、ツイーン40、ツイーン80を含む溶液を備える容器を含む、請求項125に記載の組成物。

  127. 異なる細菌種の複数の液体培養試料をファージに曝露すること、及び
    ファージが該複数の異なる細菌種に感染するか判定すること
    を含む、ファージの標的細菌を特定する方法。

  128. ファージが複数の異なる細菌種に感染するか判定することは、試料における細胞の透明化の測定を含む、請求項127に記載の方法。

  129. 試料における細胞の透明化が、該試料中の細菌種がファージの標的細菌であることを表す、請求項128に記載の方法。

  130. ファージが第1マーカーをコードする異種性核酸配列を備え、ファージが複数の異なる細菌種に感染するか判定することが複数の試料中の該マーカーの存在についてアッセイすることによる、請求項127に記載の方法。

  131. 試料中のマーカーの検出が、試料中の細菌種がファージの標的細菌であることを表す、請求項130に記載の方法。

 

 

Patent trol of patentswamp
類似の特許
サンプル作成のための1つの超音波発生装置を含む装置、システムおよび方法が提供される。1つの超音波発生装置は、1つの溶液を混合、再懸濁、エアロゾル化、分散、破壊、または脱ガスするために使用され得る。1つの超音波発生装置は、1つのサンプルの1つの病原体細胞のような1つの細胞を破壊するために使用され得る。サンプル作成は、病原体を検出、同定、または測定するために超音波発生によって病原体同定物質にさらすことを含み得る。1つの超音波発生装置は、前記サンプル含む1つの容器の1つの外壁に、その先端を接触させることにより、前記サンプル溶液に超音波エネルギーを輸送し得る。1つの超音波発生装置を含む多目的装置は、また、追加の作用および検定のための更なる構成要素を含む。そのような装置を含む装置、およびシステムは、サンプル検定および分析のための1つのシステムで1つの実験室または他の装置と通信し得る。
本発明は、膣感染症を評価するための診断方法に関し、この方法は、特異的タンパク質の使用を含む。本発明はさらに、膣感染症の抗生物質による治療後の感染からの回復を評価するため、及びこの感染の回復及び寛解を予測するための診断方法における特異的タンパク質の使用に関する。本発明はまた、リファキシミンによる治療後の膣感染症からの回復を評価するため、及びこの感染の回復及び寛解を予測するための特異的タンパク質の使用を含む診断方法に関する。
試料中の微生物(例えば、細菌)の存在、不在または合計のいずれかを決定するための方法。本方法によれば、複合マトリックスを含有する生物試料が得られる。この試料を最初に樹脂と化合させて複合マトリックスを試料から吸着する。樹脂を生物試料から除去する。このように調製された試料を次にフローサイトメトリーによって分析する。
【課題】生体サンプル中、特に尿サンプル中でのバクテリア類の同定を可能とすること。
【解決手段】生体サンプル、特に尿サンプル中のバクテリア類を同定する方法であって、前記方法は、特有なバクテリア類のグラフプロットでの特徴を同定するために、前記サンプル中の代謝生成物及び異化産物などの揮発成分のガスクロマトグラフ質量分析法(GC/MS)による分析を実行することを提供する方法である。
【選択図】 図1
試料中の感染性微生物の有無を判定するために、分析用の生体試料(例えば血液)中の微生物を迅速に検出する方法、及び装置が、本明細書において説明されている。装置は、蓋、及びトレイを有するカートリッジと、多量の試料を複数の少量の試料に分ける機構と、微生物の有無を判定するために、トレイに配置されたセンサとを含む。カートリッジ蓋は、第1の位置では、試料が、カートリッジトレイ内で均一に分散することを可能にし、かつ第2の位置では、試料を、複数のより少量の試料に分ける凸部を含む。この装置、及び方法により、試料中の微生物を検出するまでの時間が短縮され、試料の採取から、微生物の検出までに必要とされるステップが減少する。
本開示は、プロバイオティックアルギニン分解性口腔用組成物、プロバイオティックアルギニン分解性口腔用組成物の製造方法、ならびに、プロバイオティックアルギニン分解性口腔用組成物の使用によって、口腔内でのアルギニン分解活性を増加させる方法、ならびに/または、虫歯を治療および/もしくは予防する方法を提供する。
検査試料を培養するための容器は、成形したモノリシックの単一層のポリマー容器の本体を備え、この容器の本体は内面を備えるとともに上方に延在する透視性の壁を有し、壁の厚さが約0.2ミリメートルと10ミリメートルとの間である。この容器は、シリカを含み、密封される容器の本体の内面上に存在する薄いガスバリアコーティングと、ガスバリアコーティング上に存在する内側上面コーティングも有する。このガスバリアコーティングと上面コーティングとは(硬化後に)透視的である。この容器は、容器の本体に密封可能に取り付けられるキャップを備える。オートクレーブを行いエージングさせた後の、密封された容器の酸素透過率(OTR)は約0.0001から約0.04 (cc/package/day/atm)の間である。
【選択図】図1
培養器中の微生物コロニーを同定する方法が提供される。方法は、撮像装置を使用して、培養器の前面に照明を提供しながら、薄膜培養器の第1の画像を生成し、培養器の背面に照明を提供しながら、薄膜培養器の第2の画像を生成することを含む。方法は更に、第1及び第2の画像を解析して、各画像中の微生物コロニーを同定することと、培養器中の特定の位置におけるコロニーのサイズパラメータの第1及び第2の画像の値を解析することと、これら値を比較することと、を含む。方法は、少なくとも2つのコロニーの種類を区別及び計数するために使用され得る。
【選択図】図1
本発明は、a)サポニン、b)遊離核酸を溶解させることができる酵素溶液、及びc)場合によっては溶液中の溶解されない目的微生物の沈殿のための薬剤を用いる、目的微生物及び/又は目的微生物の核酸の選択的単離のための方法及びその使用に関する。本発明は、インビトロ診断の分野に好ましい適用を見出す。
【選択図】なし
本発明は、微細流体光反応装置及び光反応特性が変化した単細胞生物体を選別する方法を提供する。本発明によると、前記微細流体システムを利用して、走光性をベースに改良された単細胞生物体を効果的に利用することができる。また、細胞単位で容易なモニタリングが可能で、収集した結果の統計的分析を含んだ様々な分析を介して、変化した光反応性及び/または光敏感性を持つ突然変異菌株を容易に、また高速で選別できて、走光性及び光転換効率の相関解明、光転換効率が向上した改良された単細胞生物体選別に有用に活用できる。
To top