粘土鉱物およびアルカリ性溶液を使用して核酸含有試料を調製するための方法

 

本発明は、DNAおよびRNA標的分子の両方の検出用の生物学的試料の調製に関する迅速で極めて有効な方法を提供する。上記方法は、粘土鉱物による試料の処理、続くアルカリ性溶液による試料の溶解を含む。上記方法は、DNAおよびRNA標的の同時検出用の、血液または血漿などの複雑な生物学的試料を調製するのに特に適している。本発明の方法により調製される試料は、PCR増幅における標的として直接使用され得る。本発明の方法は、診断用途および他の用途用に分子分析を実施するためのさらなるステップおよびデバイスと利便性良く併用させてもよい。

 

 

政府の利益についての声明
本明細書に記載された研究への部分的な資金供与は、契約番号W81XWH−10−2−0158の下、The U.S. Army Medical Research Acquisition Activityからの助成金によって提供された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は概して、分子診断適用のための試料を加工処理するための方法に関する。
多くの診断、研究および開発手順は、生物学的試料中に存在する特異的な核酸(DNAまたはRNA)配列の検出を必要とする。例えば、核酸検出方法を使用して、その存在が、感染性疾患の原因を示し得る細菌、ウイルスまたは他の微生物を同定する。核酸バイオマーカーは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、汎流行性インフルエンザおよびデング熱を含む世界的な健康の高い重要性のいくつかの感染性疾患に関する標的分析物である。また、ヒト組織などのより複雑な標本(specimen)の核酸は、がんまたは遺伝子疾患に関連付けられる突然変異の存在を確立するために、ますます一般的に試験される。事件現場から直接採取される血液などの生物学的組織の試料中の核酸の検出はまた、例えば、父系試験または法医学的分析として、試料が由来する個体の正体を決定するのに使用される。
核酸分子が上述の目的のいずれかに関して検出され得る前に、生物学的材料の試料から入手可能な目的の特異的な核酸を作製することが必要である。生物学的標本から核酸を放出させるプロセスは、当該技術分野において「試料調製」として一般的に公知である。多くの場合、標的核酸は、ウイルス粒子、細菌細胞、真菌細胞、またはヒト白血球などのより複雑な生物体の細胞内に含有される。
試料調製中、細胞またはウイルス粒子は、膜およびタンパク質性被膜を溶解または変性させるように、化学的にまたは酵素的に処理されてもよく、これは核酸の放出をもたらす。溶解のこのプロセスは、一般的に「溶解」と称され、かかる溶解材料を含有する得られた溶液は、「溶解物」または「抽出物」と称される。不運にも、かかる放出は、核酸の破壊が放出時に即座に開始するような存在量で存在し得る、試料中に存在する内因性ヌクレアーゼによる分解に、核酸を曝す。続く精製プロセス中に残存する任意のヌクレアーゼは、無傷の核酸を分解し続けることができ、試料からの標的分子の損失をもたらす。ヌクレアーゼは、ほとんどの生物学的試料中で豊富であり、他の酵素を不活性化することが公知である処理に極めて抵抗性である場合が多い。特に、リボヌクレアーゼ(RNアーゼ)は、全てではないがほとんどの生物学的試料、特に、診断目的で最も一般的に収集される組織である血液で活性である。ヌクレアーゼの他に、多くの他のタンパク質および混入物(contaminants)が、頻繁に生物学的試料中に存在し、および/または溶解物の調製中に放出される。例えば、血液試料は、ヘムおよびヘパリン(採血中に使用される抗凝固薬)を含んでもよく、これらが多くの下流の分析手順を干渉し、および/または阻害する。
生物学的溶解物中に存在するヌクレアーゼおよび他の望ましくない生成物の問題を克服するために、酵素を不活性化するステップ、および核酸をさらに精製するステップの両方を伴う複雑なプロトコールを考案することが必要となっている。例えば、陰イオン洗剤およびチオシアン酸グアニジンなどのカオトロピック剤は、細胞および細胞内(subcellular)構造内部から核酸を放出すると同時に、ヌクレアーゼ活性を不活性化または阻害するのに使用されている。溶解物から核酸をさらに精製するために、低分子量アルコールを使用して、溶液から核酸を沈殿させることが当該技術分野で一般的である。他の高分子もまた、これらの条件下で沈殿して、核酸を捕捉する粘着性の扱いにくい塊を生じるため、エタノール沈殿前に、フェノールおよび/またはクロロホルムを含有する有害な有機溶媒混合物による試料の抽出を用いることが、多くの場合で必要となっている。
RNA分析用の試料を調製する際のさらなる挑戦は、これらの不安定な分子の完全性を保護することである。DNAとは異なり、RNAは、加水分解に対して極めて影響を受けやすい。結果として、DNA標的を含有する溶解物は、厳しい条件下で生物学的試料から調製され得るが、RNA分析用の試料の調製は通常、安定化剤、ヌクレアーゼ阻害剤ならびに冷蔵および/または凍結の使用を必要としている。2つの方法の変形が、生物学的試料からRNAを調製するのに歴史的に使用されている:化学抽出および多くの場合「固相抽出」と称されるガラス上での固定。上述するように、化学抽出方法は通常、RNアーゼを不活性化して、他の生体分子からRNAを精製するために、酸性フェノールまたはフェノール−クロロホルム溶液と併せて、高濃度のカオトロピック塩を使用する。これらの方法は、RNAの非常に純粋な調製物を提供するが、RNAは通常、アルコール沈殿ステップで、脱塩および濃縮されなくてはならない。Boomらに対する米国特許第5,234,809号に記載される固相抽出方法は、カオトロピック剤チオシアン酸グアニジンの存在下での固体状態のシリカ粒子または珪藻の核酸結合特性とともに、この作用物質の溶解特性およびヌクレアーゼ不活性化特性に依存する。シリカ結合性RNAが、エタノールを含有する高塩緩衝液で洗浄された後、RNAは、低いイオン強度緩衝液中で溶出される。
有機溶媒による水性抽出またはカオトロピック剤を必要とする試料調製方法は、長くて、有害であり、労働集約的であり、またゆっくりとしていることが容易に理解されよう。さらに、手順を実施する際に細心の注意が払われない場合には、ヌクレアーゼによる残留混入が起こる可能性があり、試料核酸は、分解または損失される。かかる試料を用いて実施される診断試験は、かかる分解に起因して偽陰性の結果を付与し得る。偽陰性の結果はまた、例えば、試料中に残存して、標的増幅手順を阻害する残留陰イオン洗剤、カオトロピック塩またはエタノール由来の化学的干渉に起因して得られ得る。陰イオン洗剤およびプロテアーゼが使用されている場合、残留タンパク質分解活性もまた、標的増幅および/またはハイブリダイゼーション検出反応で使用される酵素を分解して、偽陰性の結果をもたらし得る。’809号特許に開示される「Boomの溶解」プロトコールに基づく試料調製方法は、これらの問題を適正に対処すると一般的にみなされる。しかしながら、本発明者らは、予期せぬことに、固相抽出と組み合わせてカオトロピック塩を利用するかかる抽出方法が、HBVゲノムのPCRベースの検出用の血液または血漿試料の調製に確実には有効でないことを見出した。したがって、上述のプロトコールはいずれも、複雑な生物学的出発材料、例えば全血および血清からのDNAおよびRNA標的の両方の検出用の一般的な試料の調製に適していない。このことは、臨床検査室状況で、時間需要が非常に高い場合に、また対費用効果、毒性廃棄物流の低減および単純さが同様に最も重要である低資源地域で、感染性疾患の診断に関して特に当てはまる。
米国特許第5,234,809号明細書
この分野で進歩が成されてきたが、各種試料からの核酸の抽出、および核酸含有溶液の調製方法は、当該技術分野では必要とされ続けている。本発明は、これらの必要性を満たし、さらなる関連利点を提供する。
本発明の実施形態は、公知のプロセスの欠点を克服する試料調製方法を提供する。特に、本発明の実施形態の目的は、生物学的試料などの一般的な試料からDNAおよびRNA標的の両方の検出を可能にする試料調製方法を提供することである。本発明は、かかる未損傷の状況で、かつかかる試料が診断分析における試薬として即座に使用することができる混入の低い危険性で、核酸を供給する、これまでになく迅速で簡素で再現可能な方法を提供する。本発明の実施形態は、試料が抽出または溶解前に粘土鉱物で処理される試料調製方法に基づく。次に、試料はアルカリ性溶液で処理されて、目的の核酸を含有する細胞またはウイルス粒子から核酸を放出させる(「アルカリ溶解」)。
本発明者らは驚くべきことに、粘土鉱物による試料(例えば、生物学的試料)の前処理が、核酸分子、特にRNAを、アルカリ溶解中に加水分解から保護することを見出した。本発明の方法による粘土鉱物の使用はまた、ヌクレアーゼ媒介性分解から核酸を保護する。有利には、粘土鉱物およびアルカリ性溶液の使用を組み合わせる方法は、阻害および/または分解酵素、および/または他の混入物を十分に含まない核酸含有試料の調製を可能にし、試料が、いかなるさらなる精製ステップも必要とせずに、核酸増幅手順などの検出アッセイに直接使用することができることを見出した。したがって、本発明の実施形態は、目的のDNAおよびRNA分子の両方の検出用の複雑な生物学的試料を調製する、迅速で簡素で比較的有害でない方法を提供する。本発明はまた、小型化に特に適しており、自立型「ラブオンチップ(lab−on−a−chip)」マイクロ流体カートリッジならびに他の診断試験キットおよびデバイスと適合性である。したがって、いくつかの実施形態は、マイクロ流体環境において、例えばマイクロ流体カード上で開示する方法を実施することを対象とする。
本発明者らは驚くべきことに、方法が粘土鉱物による試料の処理を含む場合に、アルカリ溶解に基づく方法を使用して、核酸分析用の複雑な生物学的試料を調製することができることを見出した。本発明の方法は有利には、DNAおよびRNA標的分子の両方の検出用の一般的な試料を調製するのに使用することができる。本発明の方法は、本発明の方法のある特定の実施形態が、検出前に核酸のさらなる精製も単離も必要としない点で、公知の試料調製方法を上回る改善を提供する。理論により拘束されないが、粘土鉱物は、アルカリ性条件下での加水分解からの核酸の保護、ヌクレアーゼ媒介性分解からの核酸の保護、試料結合性阻害剤および他の混入物からのDNAポリメラーゼなどの下流アッセイ試薬の保護、および一般的な緩衝特性を含むが、これらに限定されないいくつかの有益な効果を提供すると考えられる。本発明により調製される核酸試料は、ヌクレアーゼ活性を本質的に含まず、修飾酵素用の優れた基質である。本明細書中に開示する試料調製方法は、DNAおよびRNAウイルスの両方の検出用の血液または血清試料の調製において特に有利である。本発明の主要な実施形態の主要な特色を以下に概要する。本発明の様々な他の目的および利点は、本発明の詳細な説明および本明細書中に提供される実施例から明らかである。
1つの実施形態では、本発明は、核酸の分析用の核酸含有試料を処理する方法に関する。上記方法は、試料を粘土鉱物と接触させることと、粘土鉱物が試料中に均一に分散されるまで、試料および粘土鉱物を混合することと、粘土鉱物を試料から実質的に除去することと、試料を、細胞およびウイルス粒子の溶解に適したpHでアルカリ性溶液と接触させて、核酸溶液を形成することと、任意選択で、核酸溶液を、核酸溶液のpHを中和するのに適した酸性溶液と接触させることとを含む。上述のいくつかの実施形態では、試料は、生物学的試料、例えば生物学的試料を含有する溶液である。
図1は、アルカリ溶解に基づくプロトコールの下で、HBVウイルス粒子を含有するヒト血漿を抽出することにより生成される試料中のHBV DNAを検出するための定量的PCR分析を示す。 図2は、粘土鉱物による処理、続くアルカリ溶解に基づくプロトコールの下で、MS2 RNAを含有するヒト血液を抽出することにより生成される試料中のMS2 RNAを検出するための定量的PCR分析を示す。 図3は、粘土鉱物による処理、続くアルカリ溶解に基づくプロトコールの下で、MS2粒子を含有するヒト血漿を抽出することにより生成される試料中のMS2 RNAを検出するための定量的PCR分析を示す。 図4は、粘土鉱物による処理、続くアルカリ溶解に基づくプロトコールの下で、HCV粒子を含有するヒト血液を抽出することにより生成される試料中のHCV RNAを検出するための定量的PCR分析を示す。 図5は、粘土鉱物による処理、続くアルカリ溶解に基づくプロトコールの下で、HBVおよびHCV粒子を含有するヒト血液を抽出することにより生成される試料中のHBV DNAおよびHCV RNAの両方を検出するための定量的PCR分析を示す。
1つの態様では、本発明は、粘土鉱物およびアルカリ溶解を使用したDNAおよびRNA標的分子の両方の分析用の生物学的試料などの試料を調製する方法である。本明細書中で記載する場合、「アルカリ溶解」は、生物学的試料中に存在する微生物細胞壁、ウイルス粒子、細胞膜および/または他の構造の可溶化をもたらすためのアルカリ性溶液の使用を指す。試料成分のこの可溶化は、かかる構造から核酸を放出するのに十分であり、それらを下流の実験適用に利用可能にさせる。好ましくは、粘土鉱物は、目的の核酸を、アルカリ溶解中に加水分解およびヌクレアーゼ媒介性分解から保護する本発明の方法における使用に関して選択される。
より広い意味では、本発明は、食品および関連製品、ワクチンおよびウイルスまたは細菌に感染した乳汁を含む任意の核酸含有出発材料に適用可能であるが、本発明の実施形態は、用いられる出発材料が、目的の核酸を含有する細菌またはウイルス粒子などの感染性因子を含有する生物学的材料(例えば、生物学的試料溶液)であるプロセスを対象とする。かかる感染した生物学的材料としては、目的の核酸を含有する全血、血漿、血清、ならびに尿、精子、唾液、痰、呼吸器洗浄液、および涙などの他の体液、ならびに/または糞便もしくは組織スワブ上に含有される任意の他のものなどの細胞材料が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的出発材料はまた、目的のバイオマーカーを含有する肺、結腸、膵臓、乳房、前立腺および細胞培養物(哺乳動物および細菌培養物など)などの正常な固形組織および癌性固形組織の両方を含み得る。
したがって、各種実施形態では、本発明は、核酸の分析用の核酸含有試料を処理するための方法を対象とし、上記方法は、
a)試料を粘土鉱物と接触させるステップと、
b)粘土鉱物が試料中に均一に分散されるまで、試料および粘土鉱物を混合するステップと、
c)粘土鉱物を試料から実質的に除去するステップと、
d)試料を、細胞およびウイルス粒子の溶解に適したpHでアルカリ性溶液と接触させて、核酸溶液を形成するステップと、
e)任意選択で、核酸溶液を、核酸溶液のpHを中和するのに適した酸性溶液と接触させるステップと
を含む。
ある特定の実施形態では、試料は、生物学的試料(例えば、血液、組織または細胞を含有する他の試料)である。試料は、各種形態で、例えば溶液、懸濁液、またはそれらの組合せとして供給され得る。各種実施形態では、試料は、生物学的試料溶液である。
上記方法で使用される粘土の正確な型は、特に限定されず、当業者に公知の粘土、例えば本明細書中に記載する特定の粘土鉱物のいずれかから選択され得る。いくつかの実施形態では、粘土鉱物は、カオリナイト、スメクタイトまたはイライト粘土鉱物を含む。異なる実施形態では、粘土鉱物は、タルクを含む。他の実施形態では、粘土鉱物は、ハロイサイトを含む。さらなる実施形態では、粘土鉱物は、ベントナイトを含む。さらに他の実施形態では、粘土鉱物は、合成粘土鉱物、例えばラポナイト(laponite)を含む。
アルカリ性溶液もまた、pHが7よりも大きければ、特に限定されない。いくつかの実施形態では、アルカリ性溶液は、KOH、NaOHもしくはLiOH、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、アルカリ性溶液は、KOHを含む。他の実施形態では、アルカリ性溶液は、NaOHを含む。異なる実施形態では、アルカリ性溶液は、LiOHを含む。上述の各種実施形態では、アルカリ性溶液は、上述の塩基のいずれかの水溶液である。
アルカリ性溶液または緩衝液は、およそ1Mの濃度で、水などの適切な溶媒中でアルカリ性塩基を混合することにより調製される。1つの実施形態では、アルカリ性溶液または緩衝液は、溶解に適したpHを得るために、およそ0.1Mの最終濃度で添加される。試験試料の有効な処理を達成するのに他の適切な濃度が本発明で使用され得ることは、当業者に理解されよう。
必要とはされないが、ある特定の実施形態は、アルカリ溶解溶液を中和するための任意選択の中和ステップを含む。中和溶液は、通常酸性(即ち、pH7未満)である。例えば、いくつかの実施形態では、任意選択の酸性溶液は、HCl、CまたはHSOを含む。いくつかの実施形態では、任意選択の酸性溶液は、HClを含む。他の実施形態では、任意選択の酸性溶液は、Cを含む。さらなる実施形態では、任意選択の酸性溶液は、HSOを含む。任意選択の酸性溶液は、任意の適した酸、例えば上述の酸のいずれかの水溶液の形態で供給され得る。
本発明の任意選択の中和ステップに関して、酸性溶液または緩衝液は、アルカリ溶解緩衝液を、およそpH7.2などの、およそ生理学的pHへと中和するのに十分な濃度で添加される。1つの実施形態では、酸性緩衝液または溶液は、およそ0.1Mの最終濃度で添加される。
目的の核酸を含有する任意の試料は、ここで開示される方法で使用され得る。ある特定の実施形態では、試料は、1つまたは複数の感染性因子を含む。これらの実施形態のいくつかでは、1つまたは複数の感染性因子は、ウイルス性因子である。いくつかの実施形態では、試料は、少なくとも2つのウイルス性因子を含む。例えば、各種実施形態では、試料は、DNAウイルスおよびRNAウイルスを含む。いくつかの実施形態では、DNAウイルスは、HBVであり、他の実施形態では、RNAウイルスは、HCVまたはHIVである。
いくつかの異なる実施形態では、試料は、血液、血漿、血清、尿、唾液、痰、呼吸器洗浄液、涙および組織スワブから選択される。より特定の実施形態では、試料は、血液、血漿および血清から選択される。
様々な異なる実施形態では、上記方法は、核酸増幅ステップをさらに含み、例えば、核酸増幅ステップは、PCR、RT−PCR、qPCRおよびqRT−PCRから選択される。
開示される方法は、任意の一般的な研究室フォーマットでの、および様々な規模での使用に適している。ある特定の実施形態では、方法は、マイクロ流体カードにおいて実施される。
「核酸」という用語は、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを含み、リボヌクレオチド(RNA)およびデオキシリボヌクレオチド(DNA)を含むが、これらに限定されない任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。核酸は、単鎖もしくは二重鎖もしくは他のコンホメーション、またはそれらの任意の組合せで存在し得る。比較的短い核酸ポリマーは多くの場合、「プライマー」または「プローブ」として使用される。定義は、メチル化され得るか、またはキャップされ得る天然供給源由来の核酸、また置換または誘導体化された核酸塩基を含有することができ、かつペプチド骨格に基づき得る合成形態を包含する。核酸は概して、アデノシン、グアニン、チミンおよびシトシンならびにそれらの「デオキシ」形態のポリマーであるが、ウラシルおよびキサンチンなどの他のピリミジン、またはスペーサーおよびデオキシイノシンなどの普遍的塩基も含有し得る。デオキシ核酸は、相補的配列の存在または非存在、ならびにpH、塩濃度、温度の条件、およびホルムアミド、n,n−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドおよびn−メチルピロリジノンなどのある特定の有機溶媒の存在または非存在に応じて、単鎖または二重鎖であり得る。
「試料」または「試験試料」は、核酸を含有する任意の試料を包含する。各種実施形態では、試料は、臨床標本であり得る生物学的試料または「生体試料(biosample)」である。代表的な生体試料としては、例えば、試験され得る血液、血清、血漿、バフィーコート、唾液、創傷滲出液、膿、肺および他の呼吸器吸引液、鼻吸引液および洗液、副鼻腔の排液(sinus drainage)、気管支洗浄液、痰、中耳および内耳吸引液、嚢胞吸引液、脳脊髄液、糞便、下痢液、尿、涙、乳腺分泌物、卵巣内容物、腹水液、粘液、胃液、胃腸内容物、尿道分泌物、滑液、腹腔液、胎便、膣液または分泌物、羊水、精液、陰茎分泌物等が挙げられる。粘膜分泌物および上皮を代表とするスワブまたは洗浄液、例えば全ての種類の組織標本のホモジネート、溶解物および消化物であるような咽頭、扁桃腺、歯肉、鼻腔、膣、尿道、直腸、下部結腸および眼の粘膜スワブからのアッセイが許容可能である。哺乳動物細胞は、許容可能な試料である。生理学的または生物学的流体の他に、水、産業廃棄物、食品、乳汁、空気濾過物等の試料もまた、試験標本である。いくつかの実施形態では、試験試料は、開示する方法に直接付され、他の実施形態では、分析前の加工処理が企図される。
本発明の方法に特に適している標的感染性因子は、DNAベースのゲノムまたはRNAベースのゲノムのいずれかを有する微生物およびウイルスである。いくつかの実施形態では、適切なウイルスとしては、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)IおよびII、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)AおよびB、ヒトメタニューモウイルス(MPV)ならびに単純ヘルペスウイルス(HSV)IおよびIIが挙げられるが、これらに限定されない。
他の実施形態では、本発明により検出され得るウイルス感染性因子としては、インフルエンザA、インフルエンザB、RSV(呼吸器合胞体ウイルス)AおよびB、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトT細胞リンパ球好性(lymphocytotrophic)ウイルス、肝炎ウイルス(例えば、B型肝炎ウイルスおよびC型肝炎ウイルス)、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、風疹ウイルス、レオウイルス、ノロウイルス、ヒトメタニューモウイルス(MPV)、単純ヘルペスウイルス1および2(HSV−1およびHSV−2)、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、狂犬病ウイルス、ライノウイルス、リフトバレー熱ウイルス、マールブルグウイルス、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、エボラウイルス、コロラドダニ熱ウイルス(CTFV)および/またはライノウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
異なる実施形態では、本発明により検出され得る細菌感染性因子としては、Escherichia coli、Salmonella、Shigella、Campylobacter、Klebsiella、Pseudomonas、Listeria monocytogenes、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium avium−intracellulare、Yersinia、Francisella、Pasteurella、Brucella、Clostridia、Bordetella pertussis、Bacteroides、Staphylococcus aureus、Streptococcus pneumonia、B−溶血連鎖菌(B−Hemolytic strep.)、Corynebacteria、Legionella、Mycoplasma、Ureaplasma、Chlamydia、Clostridium difficile、Gardnerella、Trichomonas vaginalis、Neisseria gonorrhea、Neisseria meningitides、Hemophilus influenza、Enterococcus faecalis、Proteus vulgaris、Proteus mirabilis、Helicobacter pylori、Treponema palladium、Borrelia burgdorferi、Borrelia recurrentis、リケッチア病原体(Rickettsial pathogens)、Nocardia、Acitnomycetesおよび/またはAcinetobacterが挙げられるが、これらに限定されない。
さらに他の実施形態では、本発明により検出され得る真菌感染性因子としては、Cryptococcus neoformans、Blastomyces dermatitidis、Histoplasma capsulatum、Coccidioides immitis、Paracoccicioides brasiliensis、Candida albicans、Aspergillus fumigatus、藻菌類(Phycomycete)(Rhizopus)、Sporothrix schenckii、黒色真菌症(Chromomycosis)および/またはマズラ菌症(Maduromycosis)が挙げられるが、これらに限定されない。
さらなる実施形態では、本発明により検出され得る寄生虫因子としては、Plasmodium falciparum、Plasmodium malaria、Plasmodium vivax、Plasmodium ovale、Onchocerca volvulus、Leishmania、Trypanosoma spp.、Schistosoma spp.、Entamoeba histolytica、Cryptosporidium、Giardia spp.、Trichomonas spp.、Balantidium coli、Wuchereria bancrofti、Toxoplasma spp.、Enterobius vermicularis、Ascaris lumbricoides、Trichuris trichiura、Dracunculus medinensis、吸虫(trematode)、Diphyllobothrium latum、Taenia spp.、Pneumocystis cariniiおよび/またはNecator americanusが挙げられるが、これらに限定されない。
概して、「粘土鉱物」という用語は、本明細書中で使用および定義される場合、層(シート状)構造および非常に小さな粒径(通例は2マイクロメートル未満)を有する含水ケイ酸アルミニウムまたはマグネシウム(フィロケイ酸塩を含む)の群のいずれかを指す。粘土鉱物は、相当量の鉄、アルカリ金属またはアルカリ土類を含有し得る。粘土鉱物は、天然に存在する粘土および粘土岩の主な鉱物ストックを形成して、かかる地質堆積物から生産される。粘土鉱物はまた、シルト岩、粘土粘板岩ならびにいくつかの砂および砂岩などの他の天然供給源に由来し得る。粘土鉱物はまた、合成的に生産されてもよい。
「フィロケイ酸塩」という用語は、本明細書中で使用および定義される場合、Siの組成またはケイ素対酸素の2:5の比を有するケイ酸塩4面体の平行シートを形成するシート状ケイ酸塩として記載されるより広範囲の種類の鉱物を包含する。フィロケイ酸塩は、下記群:アンチゴライトおよびクリソタイルの蛇紋石群、魚眼石群、ぶどう石群、および以下に記載する粘土鉱物群を含む。タルクとして公知である鉱物を含むこれらのフィロケイ酸塩のいずれも、本発明における使用に適している。
粘土鉱物は、化学組成の変動を含む各種基準に従って分類されている。本明細書中に開示する実施形態における使用に適した粘土鉱物としては、下記群:カオリナイト群(例えば、カオリナイト、ジッカイト、ナクライト、ハロイサイト、ヒシンゲライト)、モンモリロナイト/スメクタイト群(例えば、バイデライト、パイロフィライト、バーミキュライト、ソーコナイト、サポナイト、ノントロナイトおよびモンモリロナイト、タルクは多くの場合、この群に配置されるが、必ずしもそうであるとは限らない)、イライト(または粘土−雲母)群(例えば、白雲母、イライト)、および緑泥石群(例えば、アメス石、ベイリクロア、シャモス石、斜緑泥石、カメレライト、クーク石、コランドフィライト(corundophilite)、月桂石、デレス石、ゴニエライト(gonyerite)、ニマイト(nimite)、オディナイト(odinite)、オルソシャモス石、苦土緑泥石、パンナンタイト(pannantite)、リピドライト(rhipidolite)、プロクロア(prochlore)、須藤石、チュリンゲン石)の粘土が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に適した他の粘土鉱物としては、アルバイト、フィリップサイト、方沸石およびギブス石が挙げられる。
粘土鉱物はまた、それらの原子構造により当該技術分野で定義される。一連の1つの4面体と1つの8面体層で形成される粘土鉱物はそれぞれ、2層粘土鉱物、1:1鉱物、または4面体層の間隔(専門用語では、底間隔と称される)後の7Å粘土鉱物と称される。この群は、例えば、カオリナイト、ハロイサイト、ジッカイトおよびナクライトを含む。1つの8面体および2つの4面体層の形成からの粘土鉱物は、3層、10Å鉱物、または2:1鉱物と称される。この群は、例えば、イライト、およびスメクタイト、海緑石およびバーミキュライトを含む。モンモリロナイトは、スメクタイト群の主な代表であり、ベントナイトの主な構成成分である。実際に、ベントナイト、スメクタイトおよびモンモリロナイトは、多層ケイ酸塩に対する同義語として一般的に使用される。さらなる独立した8面体層が3層形成間に組み込まれる場合、4層、または14Å鉱物が生産される。この群の代表は、緑泥石である。特殊な粘土鉱物群は、間に挟まれた鉱物により代表とされる。層パッケージ間では、イオンおよび水分子は、例えば包埋されるようになり得る。これは、スメクタイトに一般的に観察される層間隔の拡張(膨張)を引き起こし得る。本明細書中に記載する粘土鉱物および粘土鉱物構造はいずれも、本発明の実施に適している。
本明細書中に記載するような粘土鉱物の各種型は、Thiele Kaolin Co.(サンダーズビル、Ga.)、Imerys(ロズウェル、Ga.)、Dry Branch Kaolin Co.(ドライブランチ、Ga.)、Millennium Inorganic Chemicals(ボルティモア、Md.)およびMinerals Technology Inc.(Specialty Menerals、ベツレヘム、Pa.)、BYK−Chemie GmbH(ウェーゼル、ドイツ)、Sigma−Aldritch(セントルイス、Mo.)、American Colloid Company(アーリントンハイツ、Il)などの会社から市販されている。
上述するように、本発明の実施形態は、核酸分析用の生物学的試料の調製における粘土鉱物の使用を対象とする。本発明の意義内での粘土鉱物は、任意の単一の粘土鉱物または種々の粘土鉱物の混合物であり得る。特定の実施形態によれば、モンモリロナイトまたはベントナイトが使用される。モンモリロナイトは、商品名MK10で入手可能である。実際に、ベントナイト、モンモリロナイトおよびスメクタイトは、多層ケイ酸塩に関する同義語として一般的に使用される。モンモリロナイトは、純粋な粘土鉱物である。ベントナイトは、イライトおよびカオリナイトもまた含有し得る主にモンモリロナイトの純粋でない混合物である。ベントナイトの主な型は、粘土のシート間の優勢陽イオン:カリウム、アルミニウム、ナトリウムまたはカルシウムにより定義される。本発明で使用する場合、ベントナイトは、ナトリウムを含有するが、ベントナイト粘土の全ての型が、本発明の実施に適している。別の実施形態によれば、ハロイサイトが、粘土鉱物として使用される。本発明のさらに別の実施形態によれば、フラー土が、粘土鉱物として使用される。フラー土は、モンモリロナイト、カオリナイトおよびアタパルジャイト、ならびに方解石および石英のような他の鉱物を含む複雑な混合物として、当該技術分野で公知である。本発明の別の実施形態によれば、合成粘土ラポナイト(BYK−Chemie GmbH(ウェーゼル、ドイツ))が、粘土鉱物として使用される。以下で「粘土鉱物」について言及するときはいつでも、この用語はまた、上述の粘土の混合物を包含すると意図される。
本発明の実施形態によれば、目的の核酸を含有することが疑わしい試料を、アルカリ溶解処理前に粘土鉱物と混合させる。アルカリ性緩衝液は、核酸を放出するために試料中で細胞および/またはウイルス粒子を溶解させる目的で使用される。本発明の方法に関して、緩衝液中での変性アルカリ性塩基の存在は、細胞および/またはウイルス粒子の溶解に十分である。
本発明の方法では、目的の核酸を含有することが疑わしい試料、例えば、生物学的試料をまず、粘土鉱物と接触させる。いくつかの実施形態では、例えば試料が生物学的試料である場合、生物学的試料は、懸濁溶液の形態で存在する。溶液中に所与の生物学的試料を懸濁させるのに使用される方法は、その性質に依存する。いくつかの液体試料、例えば血液製剤または尿は、さらなる懸濁を必要としない。場合によっては、液体溶液は、リン酸緩衝食塩水(PBS)または類似の希釈剤による希釈を必要とする。動物組織の多くの形態が、凍結および微粉砕などの、またはブレンダ−もしくは他の機械的混合デバイスを用いた均質化による、懸濁前のより激しい処理を必要とする。本発明の懸濁溶液は好ましくは、水溶液であり、より好ましくは緩衝液を含む、さらに好ましくはおよそpH6.0での酢酸緩衝液をさらに含む水溶液である。
粘土鉱物は、試料と接触させる際には乾燥していてもよい。試料が水溶液中に存在する場合には、粘土鉱物は、試料溶液中で湿潤化(hydrate)および懸濁するようになる。あるいは、粘土鉱物は、試料と接触させる前に、水性緩衝液中に湿潤化および懸濁させてもよい。本発明の1つの実施形態では、水性緩衝液は、およそpH6.0の酢酸緩衝液である。
本発明の1つの実施形態では、粘土鉱物は、20mg/mLの濃度で試料溶液に添加される。およそ1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、75mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mLから最大約160mg/mLまでなどの他の適切な濃度が企図される。試料溶液に添加される粘土鉱物の量は、標的核酸の分解を防止して、下流の分子分析を干渉するのに十分な量であることが理解されよう。
本発明の試料を調製する方法では、試料は、粘土鉱物とさらに混合される。混合ステップは、好ましくは、試料中の核酸を分解することが可能なタンパク質が実質的に不活性化されるまで、かかる期間、周囲温度で試料および粘土鉱物をインキュベートすることにより実施される。概して、これは、粘土鉱物が試料全体にわたって均一に分散されるようになるのに必要な時間である。本発明の1つの実施形態では、試料および粘土鉱物は、約5分〜約30分間混合される。各種実施形態では、粘土鉱物は、生物学的試料、例えば生物学的試料溶液と混合される。
本発明の試料を調製する方法では、次に、湿潤化された粘土鉱物が、試料から実質的に除去される。「実質的に除去される」とは、除去後に試料中に残存する残留粘土の量が、特許請求される方法の続くステップ(複数可)を干渉も、阻害もしないことを意味する。粘土鉱物の実質的な除去は、当該技術分野で周知の方法により達成され得る。1つの実施形態では、混合された試料を、室温でおよそ2分間、微量遠心機中で回転させて、粘土鉱物をペレット状にして、実質的にきれいになった試料溶液の除去を可能にし得る。本発明の別の実施形態では、混合試料を0.45μM中性フィルターに通して濾過して、実質的に粘土鉱物を含まない試料溶液を得てもよい。
本発明の試料を調製する方法では、粘土処理した試料のpHが、アルカリ溶解溶液を添加することによりアルカリ性pHに調節される。アルカリ溶解溶液は、塩基、好ましくは溶液のpHを、細胞膜および/またはウイルス粒子の構造が崩壊(即ち、「溶解」)されて、目的の核酸が放出されるレベルに上げるのに十分強いが、単離されるべき核酸材料に損傷を与えるほど強くはない塩基を含む。1つの実施形態では、塩基は、水酸化カリウム(KOH)である。別の実施形態では、塩基は、水酸化ナトリウム(NaOH)または水酸化リチウム(LiOH)から選択される。アルカリ性溶液または緩衝液は、およそ1Mの濃度で、水中でアルカリ性塩基を混合することにより調製される。1つの実施形態では、アルカリ性溶液または緩衝液は、およそ0.1Mの最終濃度で添加されて、およそ5分〜最大およそ30分間、およそ室温でインキュベートされる。
本発明の方法は、任意選択の中和ステップを含む。いくつかの適切な酸が、本発明の任意選択の酸性溶液または緩衝液として使用され得る。例示的な酸としては、塩酸(HCl)および酢酸(C)が挙げられる。酸性溶液または緩衝液は、およそ1Mの濃度で酸を水と混合することにより調製される。本発明の任意選択の中和ステップに関して、酸性溶液または緩衝液は、アルカリ溶解緩衝液を、およそpH7.2などのおよそ生理学的pHへと中和するのに十分な濃度で添加される。1つの実施形態では、酸性緩衝液または溶液は、およそ0.1Mの最終濃度で添加される。
本発明の方法により調製される核酸含有試料は、いかなるさらなる精製ステップも単離ステップもなしで、続く増幅手順(PCRベースの手順)に直接使用され得る。本発明の方法により調製される単一の核酸含有試料はまた、DNAおよびRNA標的分子の両方を検出するのに使用され得る。PCRを使用した核酸の増幅および検出に関する一般的な原理および条件はとても周知されており、それらの詳細は、米国特許第4,683,195号(Mullisら)、米国特許第4,683,202号(Mullis)および米国特許第4,965,188号(Mullisら)を含む数多くの参照文献に提供されており、それらの全てが、参照により本明細書に援用される。好ましくは、PCRは、熱安定性DNAポリメラーゼを使用して実施される。いくつかの適切な熱安定性DNAポリメラーゼが、米国特許第4,965,188号(Gelfandら)および米国特許第4,889,818号(Gelfandら)に詳細に言及されるものを含めて当該技術分野で報告されており、ともに、それらの全体が参照により本明細書に援用される。他の増幅プロトコールとしては、LAMP(DNAリガーゼ連鎖反応(「LCR」)のループ媒介性等温増幅)、核酸配列ベースの増幅(NASBA)を含む転写ベースの増幅系(TAS)が挙げられ、「ローリングサイクル」、「RACE」および「非対称的PCR」とも称される「片側(one−sided)PCR」もまた使用されてもよく、検出可能なプローブに相補的な鎖が過剰に合成されるという利点を有する。
いくつかの実施形態では、RNAレベルを決定するための方法は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、特に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)による増幅ベースの方法である。増幅ステップ前に、mRNAのDNAコピー(cDNA)が合成されなくてはならない。これは、別個のステップとして実施され得る逆転写により、またはRNAを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応の改変であるホモジーニアス逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)で達成される。リボ核酸のPCR増幅に適した方法は、RomeroおよびRotbart、Diagnostic Molecular Biology: Principles and Applications 401〜406頁;Persingら編、Mayo Foundation, Rochester, Minn.、1993年;Eggerら、J. Clin. Microbiol. 33巻:1442〜1447頁、1995年;および米国特許第5,075,212号により記載されており、これらは全て、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
アッセイは、エンドポイントまたは動態(「実時間」とも称される)検出を含み得る。プローブなどの指示試薬が使用される場合、それは、増幅中、または増幅後に添加され得る。当該技術分野で公知の蛍光プローブ、蛍光消光プローブおよび「アップコンバーティング(up−converting)」蛍光プローブが好ましい。
標的核酸レベルの定量化は、例えば製造業者の指示書に従ってABI PRISM(商標)7600、7700または7900配列検出システム(PE−Applied Biosystems、フォスターシティ、カリフォルニア)を使用して、実時間定量的PCR(qPCR)により達成され得る。多くの他の適切な検出システム、例えば、Qiagen ROTOR−GENE(商標)およびBioRadにより提供される類似のシステムが利用可能である。これらは、蛍光検出システムであり、これにより、実時間でのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)生成物のハイスループット定量化が可能となる。PCRが完了した後に増幅生成物が定量化される標準的なPCRとは対照的に、実時間定量的PCRにおける生成物は、それらが蓄積するにつれて定量化される。これは、PCR反応において、フォワードおよびリバースPCRプライマー間で特異的にアニーリングして、2つの蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドプローブを含むことにより達成される。
1つの実施形態では、蛍光オリゴヌクレオチドプローブは、溶液中の特異的な核酸の存在を報告するように設計された単鎖ヘアピン形状のオリゴヌクレオチドプローブである「分子ビーコン」である。分子ビーコンは、4つの構成成分;基部、ヘアピンループ、末端が標識されたフルロオロフォアおよび反対の末端が標識されたクエンチャーからなる。ヘアピン様ビーコンが標的に結合されない場合、フルオロフォアおよびクエンチャーは、すぐ近くに位置し、蛍光が抑制される。相補的な標的ヌクレオチド配列の存在下では、ビーコンの基部が開放して、標的とハイブリダイズする。このことが、フルオロフォアおよびクエンチャーを分離させて、フルオロフォアが蛍光を発するのを可能にする。あるいは、分子ビーコンはまた、末端が標識されたドナーに近接して発光するフルオロフォアを含む。「波長シフト分子ビーコン」は、フルオロフォアがより強力に発光するのを可能にするさらなるハーベスターフルオロフォアを組み込む。分子ビーコンの現在の概説としては、Wang Kら、2009年、Molecular engineering of DNA:molecular beacons. Angew Chem Int Ed Engl、48巻(5号):856〜870頁;Cissell K Aら、2009年、Resonance energy transfer methods of RNA detection、Anal Bioanal Chem 393巻(1号):125〜35頁およびLi Yら、2008年、Molecular Beacons: an optimal multifunctional biological probe、Biochem Biophys Res Comm 373巻(4号):457〜61頁が挙げられる。最近の進歩としては、Cady N C、2009年、Quantum dot molecular beacons for DNA detection. Methods Mol Biol 554巻:367〜79頁が挙げられる。
蛍光シグナルを検出するための手段は、定性的または定量的であり得るアッセイのエンドポイント、即ち結果を表示するための当該技術分野で周知の装置を含んでもよく、分光光度計、蛍光光度計、ルミノメーター、光電子増倍管、光ダイオード、比濁計、光子計数器、電圧計、電流計、pH計、容量性センサー(capacitative sensor)、無線周波数トランスミッター、磁気抵抗計(magnetoresistometer)またはホール効果デバイスを装備した機械を含んでもよい。カバープレートにおける拡大レンズ、光学フィルター、着色した流体および標識されたプローブを使用して、アッセイの結果の検出および解釈を改善させてもよい。
本明細書中で使用する場合、「約」、「およそ」および「概して」という用語は、不正確さの表現を広くするものであり、「ほぼ」の意味での「多かれ少なかれ」、「おおよそ」または「大体」であるという状態について記載しており、ここで変動は、ほんのわずかであるか、明確であるか、または等価な有用性もしくは機能を有し、さらに標準、規則または限界に対して明確なごくわずかな例外の存在をさらに示している。例えば、各種実施形態では、上述の用語は、用語に続く値の20%、10%、5%、1%または0.1%内の量を指す。
下記実施例は、本発明のある特定の例示的な実施形態を提供するために提示され、本発明の範囲を限定するものとは意図されない。
(実施例1)
DNAおよびRNA標的の両方の検出用の試料を調製するための簡素な方法
この実施例は、DNAおよびRNA標的の両方の検出用の生物学的試料からの核酸の調製に関する簡素で有効な方法を実証する。
本発明者らは、カオトロピック塩、ガラス/シリカ基板、およびプロテイナーゼKの使用に基づく核酸抽出プロトコール(当該技術分野では「Boomの溶解」として公知である)が、驚くべきことにB型肝炎ウイルス(HBV)の定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)検出用の試料を調製するのに無効であることをこれまでに見出してきた。このDNAウイルスを検出する代替的な試料調製方法を同定するために、アルカリ溶解に基づくプロトコールを研究した。
分析用の試料を生成するために、ヒト血漿を、頂部が紫の標準的なEDTA収集チューブ中に収集した全血から得、続いて2000rpmで20分間遠心分離を行い、血漿を赤血球と分離させた。次に、血漿を除去して、1×10個のコピー/μL(ウイルスの試料)の濃度のHBV 50μLを、血漿またはPBS 2mLに添加することにより、HBVまたはMS2 RNAファージのいずれかでスパイクした。スパイクした血漿試料を、最終濃度0.1Mで水酸化ナトリウム(NaOH)と室温で60分間混合することにより、アルカリ溶解を使用して、試料を抽出した。その後、試料は、0.1M塩酸(HCl)の添加により中和して、いかなるさらなる精製ステップなしで、融解分析を用いた標準的な定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)で直接使用して、ウイルス核酸を検出した。対照として、HBV配列を含有するプラスミドを別個の試料に添加した。
図1に示されるように、アルカリ溶解は、HBVウイルス粒子でスパイクした血漿およびPBS試料から発生される強力なPCRシグナルから明らかであるように、PCR分析用のHBVでスパイクした試料を有効に抽出した。対比して、RNAファージ、MS2でスパイクした試料から、シグナルは発生せず、このプロトコールが、RNA試料の調製に適さないことを示した。RNAがアルカリ性条件下での化学的加水分解に影響されやすいため、この結果は驚くべきことではなかった。
アルカリ溶解プロトコールを、RNA標的の調製にも同様に適切となるように修飾するために、アルカリ溶解溶液前に、試料をフィロケイ酸アルミニウム粘土、ベントナイトで処理することの効果を研究した。MS2 RNAファージでスパイクした血漿を、上述するように調製し、最終濃度20mg/mLでベントナイトを含有するチューブに添加した。ベントナイト粘土が血漿試料とともに完全に湿潤化されるまで、試料を混合した。試料は、最大30分間インキュベートして、次に遠心分離して、粘土をペレット状にして、除去した。アルカリ溶解に関して、NaOHを新鮮なチューブに分取して、ベントナイトで処理した血漿50μLを最終濃度0.1Mになるように分取した。試料を10分間インキュベートして、次に最終濃度0.1MになるようにHClの添加により中和した。上述するように、いかなるさらなる核酸精製ステップなしで、試料をqRT−PCR分析に直接供して、MS2 RNAを検出した。
粘土の非存在下では、これまで観察されたように、ファージRNAは、アルカリ溶解により調製される試料では検出されなかった。しかしながら、驚くべきことに、ベントナイトによる試料の前処理、続くアルカリ溶解は、RNA標的に関して強力なPCRシグナルを付与した(データは示していない)。これらの結果により、粘土が、強力な塩基の存在下では加水分解からRNAを保護することが示される。
次に、ベントナイト粘土/アルカリ溶解プロトコールを、EDTAチューブ中に収集され、RNAファージ、MS2でスパイクした全血試料に関して試験した。粒子溶解およびPCR分析手順は、10%、25%、50%または75%溶解赤血球を含有するスパイクした血漿試料に関して上述するように実施した。図2に示されるように、各試料がシグナルを発生し、抽出した材料における無傷のウイルスRNAの存在を実証した。これらの結果により、全血が、粘土処理およびアルカリ溶解の組合せに基づく試料調製プロトコールに適した出発材料であることが示される。驚くべきことに、さらなる核酸抽出ステップも精製ステップも、RNA標的の検出に必要とされない。さらに、上述する試料調製プロトコールにおいて種々の濃度の塩基および中和酸を試験したところ、本発明者らは驚くべきことに、粘土処理した試料が、アルカリ溶解後に、かつPCR分析前に酸中和ステップを必要としないことを発見した。理論により拘束されないが、粘土が、アルカリ溶解後に中和ステップを添加する必要を排除するある特定の緩衝特性を提供すると仮定される。
(実施例2)
各種粘土鉱物とともにアルカリ溶解を使用したDNAおよびRNA標的検出用の試料調製
この実施例は、様々な粘土鉱物がDNAおよびRNA標的の両方の検出用の試料の調製に、アルカリ溶解プロトコールを適応させるのに有効であることを実証する。
この実施例では、下記鉱物を評価した:フィロケイ酸塩粘土、ベントナイト、フラー土およびモンモリロナイト(MK10)およびケイ酸マグネシウム、タルク。ヒト血漿試料を上述するように調製して、試料1つにつき10pfuでのMS2 RNAファージ、または1,600もしくは160IU/試料でのHBV DNAウイルスのいずれかでスパイクした。各粘土を、最終濃度1、10、20または40mg/mLで血漿試料に添加して、粘土が完全に湿潤化されるまで(室温でおおよそ5分)振とうさせた。粘土を遠心分離により血漿試料から除去して、最終濃度0.08Mになるように1M水酸化カリウム(KOH)を室温で5〜10分間添加することにより、試料をアルカリ溶解に供した。中和ステップは、PCR分析前に実施しなかった。ウイルスRNAの存在に関して試験するために、ウイルス特異的なプライマーを使用して、標準的な定量的RT−PCR分析を試料に関して実施した。
図3に示されるように、粘土鉱物それぞれによる試料の処理により、RT−PCRによるRNA標的検出が可能となった。対比して、ウイルスRNAは、粘土処理の非存在下では検出されなかった。試料をDNA標的の検出用に調製した場合に、類似した結果が得られた。ここで、HBVでスパイクした血漿試料は、ベントナイト、ハロイサイトまたは超微細粒径へとふるいにかけられたベントナイト粘土(ナノベントナイト)による前処理後にアルカリ溶解に供した。PCR分析前にさらなる中和ステップも精製ステップも実施せずに、ウイルス標的を検出した。これらの結果により、核酸分析用の複雑な生物学的試料を調製するために、いくつかの型の粘土がアルカリ溶解と組み合わせるのに適していることが示される。
(実施例3)
RNA標的を検出するための全血に由来する試料の調製
この実施例は、粘土溶解に基づく試料調製プロトコールを使用して、RNAウイルスの検出用に全血の抽出物を生成することができることを実証する。
全血が、PCR分析を干渉する因子を含有することは、当該技術分野で周知である。このことは、核酸ベースの診断アッセイにおいて、試料として未分画血液を使用することにおいて課題を提起している。粘土がこれらの固有の阻害特性を克服し得るかどうかを研究するために、C型肝炎ウイルス(HCV)に感染した患者に由来する血漿でスパイクした全血を、分析用の出発材料として使用した。この実験では、ベントナイトまたは合成膨潤性粘土、ラポナイトのいずれかを、アルカリ溶解前の試料処理に使用した。粘土を水中に溶解させて、最終濃度0.63〜1.33%(wt/vol)で、HCVでスパイクした全血試料に添加した。試料を室温で5分〜10分間混合して、遠心分離により粘土を除去した。上述するように、試料をKOHによるアルカリ溶解に供した。qPCR分析は、いかなるさらなる抽出ステップも精製ステップもなしで、溶解させた全血試料に対して直接実施した。HCV RNA標的は、HCV特異的プライマーおよびプローブを使用した標準的なqRT−PCRにより検出した。
PCRデータを、各データ点に関して定量サイクル(Cq)のボックスプロットとしてグラフに描き、これらは図4に記載される(Cqのより低い値は、より大量の鋳型および/またはqPCRもしくはqRT−PCRの阻害がより少ないこと)を示す)。ボックスは、データの四分位数間範囲(「IQR」、これは、データ点の25〜75%である)を表す一方で、ボックスを通る線は、データの中央値を表す。ひげは、最高および最低のデータ点を表す。四分位数間範囲が重複しない場合、データは、統計学的に有意な差により異なるとみなされる。図4で見ることができるように、ラポナイトおよびベントナイト処理はともに、全血におけるRNA標的の検出において有意な改善を提供する。これらの結果により、粘土がRNA標的をアルカリ性加水分解から保護するだけでなく、標的を、全血中に存在するヌクレアーゼからも保護することが示される。さらに、粘土およびアルカリ溶解の組合せが、PCR反応に対する血液中に存在する他の因子の阻害効果を克服し得ることが、データにより示唆される。
(実施例4)
粘土およびアルカリ溶解を用いた同時DNAおよびRNA抽出
この実施例は、粘土処理、続くアルカリ溶解に基づくプロトコールを使用して、DNAおよびRNA標的の両方を検出するための単一試料を調製することができることを実証する。
この実験では、ヒト血液を、HBVに感染した患者、およびHCVに感染した異なる患者の両方由来の血清でスパイクした。ウイルスでスパイクした血液試料を、ベントナイト、珪藻土もしくはラポナイト粘土、または対照として粘土なしで前処理した。これに続いて、上述するようにアルカリ溶解を行った。溶解した試料を、いかなるさらなる抽出ステップも精製ステップもなしで、qRT−PCR反応において直接使用し、HBVまたはHCV特異的配列を検出した。
Cqデータを、図5においてボックスプロットとして提示し、これは、3つの粘土がそれぞれ、全血試料溶解物の同じ調製物中に存在するRNAおよびDNA標的の両方の検出を有意に改善することを実証している。まとめると、これらの実施例で提示されるデータにより、粘土が、アルカリ性加水分解からのRNA標的の保護、ならびに生物学的試料抽出物中に存在する阻害剤からの核酸標的および下流アッセイ構成成分の保護を含むが、これらに限定されない核酸分析用の試料調製において数多くの有利な特性を提供することが示される。
上述の各種実施形態は、さらなる実施形態を提供するのに組み合わせることができる。2013年5月7日に出願した米国特許出願第61/820,587号を含むが、これに限定されない、本明細書中で言及され、および/または出願データシートに列挙される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は全て、それらの全体が参照により本明細書に援用される。実施形態の態様は、さらなる実施形態を提供するために各種特許、出願および刊行物の概念を用いる必要があれば、修飾することができる。これらの変更および他の変更は、上述の詳細な説明を鑑みて、実施形態に対して行うことができる。概して、下記特許請求の範囲では、使用する用語は、明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に、特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、かかる特許請求の範囲が認められる等価体の全範囲とともに、全ての考え得る実施形態を包含すると解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されない。



  1. 核酸の分析用の核酸含有試料を処理する方法であって、
    a)前記試料を粘土鉱物と接触させるステップと、
    b)前記粘土鉱物が前記試料中に均一に分散されるまで、前記試料および前記粘土鉱物を混合するステップと、
    c)前記粘土鉱物を前記試料から実質的に除去するステップと、
    d)前記試料を、細胞およびウイルス粒子の溶解に適したpHでアルカリ性溶液と接触させて、核酸溶液を形成するステップと、
    e)任意選択で、前記核酸溶液を、前記核酸溶液のpHを中和するのに適した酸性溶液と接触させるステップと
    を含む方法。

  2. 前記粘土鉱物が、カオリナイト、スメクタイトまたはイライト粘土鉱物を含む、請求項1に記載の方法。

  3. 前記粘土鉱物が、タルクを含む、請求項1に記載の方法。

  4. 前記粘土鉱物が、ハロイサイトを含む、請求項1に記載の方法。

  5. 前記粘土鉱物が、ベントナイトを含む、請求項1に記載の方法。

  6. 前記粘土鉱物が、合成粘土鉱物を含む、請求項1に記載の方法。

  7. 前記合成粘土鉱物が、ラポナイトを含む、請求項6に記載の方法。

  8. 前記アルカリ性溶液が、KOH、NaOHもしくはLiOH、またはそれらの組合せを含む、請求項1に記載の方法。

  9. 前記アルカリ性溶液が、KOHを含む、請求項8に記載の方法。

  10. 前記溶解に適したpHが、約0.1M塩基のアルカリ性溶液から得られる、請求項1に記載の方法。

  11. 任意選択の前記酸性溶液が、HCl、CまたはHSOを含む、請求項1に記載の方法。

  12. 前記試料が、1つまたは複数の感染性因子を含む、請求項1に記載の方法。

  13. 前記1つまたは複数の感染性因子が、ウイルス性因子である、請求項12に記載の方法。

  14. 前記試料が、少なくとも2つのウイルス性因子を含む、請求項13に記載の方法。

  15. 前記試料が、DNAウイルスおよびRNAウイルスを含む、請求項14に記載の方法。

  16. 前記DNAウイルスが、HBVである、請求項15に記載の方法。

  17. 前記RNAウイルスが、HCVまたはHIVである、請求項16に記載の方法。

  18. 前記試料が、血液、血漿、血清、尿、唾液、痰、呼吸器洗浄液、涙および組織スワブから選択される、請求項1に記載の方法。

  19. 前記試料が、血液、血漿および血清から選択される、請求項18に記載の方法。

  20. 核酸増幅ステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。

  21. 前記核酸増幅ステップが、PCR、RT−PCR、qPCRおよびqRT−PCRから選択される、請求項20に記載の方法。

 

 

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インターフェロン(IFN)、リバビリン(RBV)、ヌクレオシド阻害剤(NI)、2’C−メチルアデノシン(2’CMeA)、ソホスブビル(SOF)、または非ヌクレオシド阻害剤AもしくはB(NNI−AまたはNNI−B)に対するC型肝炎ウイルス(HCV)またはHCV集団の感受性を、効率的にかつ正確に決定するための方法および組成物を提供する。方法は、IFN、RBV、NI−1、2’CMeA、SOF、NNI−A、またはNNI−B感受性関するHCVの遺伝子型またはHCVの表現型を決定するステップを含んでもよい。方法は、決定された遺伝子型または表現型に基づく適切な処置の選択をさらに含んでもよい。
1以上のDNA配列が連結されるDNAデンドリマーを含む組成物であって、このDNA配列が、ポリペプチドをコードするRNAを生成させるために、または制御RNAを生成させるために、ポリペプチドまたは制御RNAをコードするDNA配列の発現を制御するDNA配列に連結されるポリペプチドまたは制御RNAをコードするDNA配列を含む、組成物が開示される。デンドリマーを細胞に送達し、続いてコードされるポリペプチドまたは制御RNAを発現させることによって、疾患および細胞の状態を処置するための方法もまた開示される。
【選択図】図2
【課題】KIR3DL1の機能サブ群に特徴的な一塩基多型 (SNPs)が開示されている。また、ゲノミックDNAからの群特異的SNPsを同定するためにユニークに設計された一連のオリゴヌクレオチドプライマー及びPCR反応条件を用いることにより、KIR3DL1対立遺伝子を分類する方法も開示されている。
【解決手段】ここに開示した組成物及び方法は、臨床設定及び研究室において有用であり、種々の疾病の予後の予想及びHCTのための最も適切なドナーの選択を可能にする。
【選択図】なし
本開示は、サンプルにおいて複数の分析対象の検出のための方法、組成物およびキットを提供する。いくらかの例では、本開示は、分析対象、遺伝的変動の検出、反応プロセスのモニタリング、および分析対象-分析対象の相互作用のモニタリングのための信号測定による方法、組成物、およびキットを提供する。いくらかの例では、信号の存在または信号における変化は、分析対象の存在または不存在を定めるのに用いることができる信号プロファイルを構築するために使用されうる。
本発明は、高解像度融解技術を用いるibv、csfv及びndvの株の弁別及び特徴付け並びに新規な株の同定方法に関する。本発明はまた、そのような方法で使用されるプライマー及びキットを提供する。
検査デバイス // JP2016507057
本発明は、実体の存在について個体を検査するためのデバイスである。実体は、病原体、毒素または薬物であってもよい。デバイスは、個体から検査されるべき生物学的試料を回収するように適合される。検査デバイスは、実体を検出するために、貴金属ナノ粒子(すなわち、金、銀、又は銅)を含む。検査結果は、デバイスの窓から読み込まれる。凝集した貴金属ナノ粒子を用いた現在の視覚限界は、約50nm〜約75nmの範囲の直径を有する塊である。実体の特異的な1つ以上のリガンドは、2つ以上の金属ナノ粒子に付着される。各個々のナノ粒子は、約15nm〜約35nmの範囲の直径を有する。ナノ粒子に付着し、実体に特異的なリガンドは、例えば、抗体、抗体断片、オリゴヌクレオチド、およびアプタマーであり得る。実体上の異なる部位に特異的な種々のリガンドは、標的の存在下でナノ粒子の凝集潜在性を高めるために使用されてもよい。検査は、試料回収後、デバイス内で行われる。アッセイの結果は、速やかに使用可能である。検査することができる条件は、例えば、ウイルス感染、細菌感染、毒素への曝露、および薬物使用を含む。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の検出は、実施例に記載されている。
本発明は、a)サポニン、b)遊離核酸を溶解させることができる酵素溶液、及びc)場合によっては溶液中の溶解されない目的微生物の沈殿のための薬剤を用いる、目的微生物及び/又は目的微生物の核酸の選択的単離のための方法及びその使用に関する。本発明は、インビトロ診断の分野に好ましい適用を見出す。
【選択図】なし
特にウィルス感染の、又は当該ウィルス感染の治療的処置の有効性の、バイオマーカーとして、少なくとも1つのmirnaを使用する方法であって、上記少なくとも1つのmirnaがmir-124である、上記方法。
【選択図】なし
ヒヒアデノウイルス(baadv)-2/4およびbaadv-3を本明細書に開示する。baadv-2/4およびbaadv-3のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ならびにbaadv-2/4および/またはbaadv-3に特異的に結合する抗体を開示する。baadv-2/4およびbaadv-3を検出するための方法を開示する。baadv-2/4および/またはbaadv-3を処置する、防止する、およびそれらに対する免疫応答を誘導するための方法も開示する。キットも提供する。
本明細書に記載されているのは、B型肝炎ウイルス(HBV)感染の治療に有用な化合物を特定するための方法である。
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